Test
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INTRODUZIONE
Rispetto alla visione storica che definiva la leucemia linfatica cronica (LLC) una malattia indolente da accumulo di piccoli linfociti, le conoscenze patogenetiche hanno consentito di riconoscere questa condizione come una malattia dinamica, che trae la sua origine da una ricca serie di eventi biologici e genetici primari e secondari. Lāinterazione con gli antigeni, lo stato di āattivazioneā cellulare che ne segue e le complesse interazioni con il microambiente plasmano una malattia dal decorso eterogeneo, talora preceduta da una condizione predisponente, la linfocitosi B-monoclonale (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL) recentemente definita nei suoi contorni nosografici. Grazie ai progressi sulla comprensione dei meccanismi che governano la storia naturale della LLC lāapproccio moderno alla gestione del paziente si avvale di una caratterizzazione clinica che prevede lo studio di una serie di marcatori prognostici, molto utili per lāadeguata programmazione di terapie sempre piĆ¹ efficaci, che includono oggi alcune molecole in grado di interferire con processi essenziali per la sopravvivenza e la crescita del linfocito neoplastico.
Definizione e cenni epidemiologici
La LLC ĆØ un disordine linfoproliferativo cronico che coinvolge i linfociti B CD5-positivi e che rientra tra le neoplasie a cellule B-mature della classificazione WHO (Muller-Hermelink HK et al, 2008). Eā piĆ¹ frequente nei maschi che nelle femmine (1,5-2,0/1), ed ha unāincidenza nei paesi occidentali, riferita a 100.000 abitanti, compresa tra 2-6 casi/anno, mentre ĆØ rara in Giappone e nei paesi orientali, ove lāincidenza ĆØ <1 caso/100.000 abitanti (Redaelli A et al, 2004) (Figura Ia).
LāetĆ media alla diagnosi ĆØ attorno ai 70 anni, e lāincidenza aumenta da 1 caso/anno/100.000 abitanti nella fascia 40-50 anni a 20 casi nella fascia 70-80 anni. Oltre il 40% delle LLC ĆØ diagnosticata ad unāetĆ >75 anni, mentre meno del 10% ĆØ diagnosticata prima dei 50 anni (Brenner H et al, 2008) (Figura Ib).
Figura I. a) incidenza nei diversi paesi; b) incidenza per etĆ
Eziologia
Lāeziologia della LLC non ĆØ nota. Non puĆ² essere escluso un ruolo per le radiazioni ionizzanti (Richardson DB et al, 2005), anche se lo studio della popolazione sopravvissuta allāincidente nucleare di Chernobyl ha mostrato un aumento di incidenza di molte forme di leucemia, ma non di LLC (Lin SL et al, 2009). Alcune attivitĆ agricole, con particolare riguardo allāimpiego di pesticidi si possono associare ad un aumento dei casi di LLC (Caporaso N et al, 2004).
Vi ĆØ evidenza di una possibile associazione tra LLC e fattori genetici. La LLC ha unāincidenza bassa nelle popolazioni orientali rispetto agli occidentali e i gruppi etnici che migrano in altri paesi mantengono lāincidenza di questa malattia al livello di quella del paese di provenienza.Ā Nei parenti di primo grado di soggetti affetti da LLC il rischio di sviluppo della malattia e di altre sindromi linfoproliferative (linfoma di Hodgkin e non Hodgkin) ĆØ superiore rispetto a quello della popolazione generale di pari etĆ e sesso (Capalbo S et al, 2000; Goldin LR et al, 2004) e si possono rinvenire espansioni di piccoli cloni B linfocitari con fenotipo classico della LLC e negativitĆ per CD38, con una frequenza francamente maggiore rispetto alla popolazione generale (Rawstron AC et al, 2002). In unāanalisi di 24 famiglie con piĆ¹ di due membri affetti si ĆØ potuto documentare, accanto alle classiche anomalie citogenetiche, una elevata frequenza di delezioni o guadagno di materiale genetico a livello delle bande Xp11.1-p21, Xq21-qter, 2p12-14 e 4q11-21 (Martin AJ et al, 2002).Ā Eā possibile che, diversamente dal cancro mammario, ove un gene (BRCA1) ha un importantissimo effetto, il substrato genetico della LLC consista nellāintervento di piĆ¹ geni con basso potenziale predisponente (Goldin LR et al, 2007).
Patogenesi
A cura di: Sara Martinelli (Struttura semplice di Ematologia- UnitĆ operativa di Medicina Interna – Ospedale S. Chiara di Trento).
La patogenesi della LLC riconosce numerosi momenti (Tabella I), incentrati sulle particolaritĆ della cellula dāorigine, sulle sue interazioni con ipotetici antigeni e con il microambiente e sullo sviluppo di una vasta gamma di lesioni genetiche.
Tabella I: Momenti patogenetici nella LLC
a) Cellula dāorigine
Per molto tempo lāespressione del CD5 da parte delle cellule della LLC ha fatto ritenere che la controparte cellulare normale fosse rappresentata dal subset di linfociti B-1 (definito nel topo, senza un chiaro corrispettivo nellāuomo), coinvolto nellāimmunitĆ innata e in grado di produrre anticorpi naturali mediante una reazione T-indipendente (Darzentas N et al, 2010). Nellāuomo, lāespressione di CD5 caratterizza le cellule B vergini, mentre viene persa dopo lāincontro con lāantigene. In una parte dei casi di LLC (50-80% nelle varie casistiche) la cellula leucemica presenta >2% di mutazioni somatiche nella sequenza del gene codificante per la porzione variabile delle catene pesanti delle Ig (IGHV), un processo (ipermutazione somatica) che fisiologicamente avviene allāinterno del centro germinativo, grazie allāintervento di enzimi quali lāactivation-induced cytidine deaminase (AID), in risposta ad antigeni T-dipendenti. La restante parte delle LLC presenta una configurazione āgermlineā della porzione variabile del gene Ig (i.e. <2% di mutazioni). Il passaggio attraverso il centro germinativo, che quindi caratterizza le LLC āmutateā, ĆØ tuttavia incompatibile con la derivazione dai linfociti B-1. Inoltre, lo studio del profilo di espressione genica ha mostrato ampia omogeneitĆ tra i diversi casi di LLC, indipendentemente dallo stato mutazionale dei geni IGHV, ed ĆØ risultato somigliante a quello delle cellule B memoria CD27+. I casi di LLC āmutateā potrebbero quindi rappresentare lāespansione di cellule B memoria CD27+ che, in seguito allāincontro con un antigene T-dipendente, hanno attraversato le fasi del centro germinativo; i casi di LLC ānon mutateā potrebbero invece derivare da una frazione minoritaria di cellule B CD27+ che hanno incontrato lāantigene in maniera T-indipendente ed hanno sviluppato un fenotipo āmemoriaā senza passaggio attraverso il centro germinativo (Klein U et al, 2001; Rosenwald A et al, 2001). Lāespressione del CD5 potrebbe essere coerente con lāorigine delle LLC āmutateā da un subset recentemente riconosciuto di cellule B memoria CD27+ CD5+, mentre per le LLC ānon mutateā lāespressione del CD5 sarebbe suggestiva di una origine da cellule B vergini pre-centro germinativo, ipotesi sostenuta anche da alcuni studi di espressione genica (Seifert M et al, 2012), non potendo tuttavia escludere che il fenotipo di superficie possa essere stato alterato dal processo stesso di trasformazione o da uno stato di anomala attivazione e che quindi il CD5 sia comunque espresso da cellule che hanno effettivamente incontrato lāantigene (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
Accanto alle controversie relative allāorigine della cellula B matura la cui espansione determina la malattia, recenti evidenze suggeriscono che le piĆ¹ precoci alterazioni genetiche ed epigenetiche che predispongono allo sviluppo della LLC si verifichino a monte, a livello della cellula staminale emopoietica pluripotente (HSCs). Per effetto di queste lesioni precoci, la cui natura non ĆØ al momento chiara, il destino di questi progenitori viene orientato verso il lineage B linfocitario, con successiva selezione, per effetto della stimolazione antigenica, di elementi maturi della loro progenie che vanno incontro ad unāespansione prima oligoclonale, quindi monoclonale per accumulo di ulteriori lesioni genetiche (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
b) Ruolo della stimolazione antigenica
Eā noto che il clone trasformato nella LLC presenta un utilizzo preferenziale di alcune famiglie V, D e J (ad esempio VH1-69; VH4-34), che non riflette la frequenza di questi riarrangiamenti nella popolazione B-linfocitaria CD5 normale. PoichĆ© queste sequenze, assemblate durante la maturazione B-linfocitaria intramidollare, formano la porzione variabile del gene Ig espressa in superficie come BCR, si puĆ² dedurre che alcuni antigeni sono in grado di ingaggiare i cloni esprimenti questi BCR favorendone lāespansione e la successiva trasformazione. Questo concetto ĆØ stato rafforzato dalla dimostrazione di āBCR stereotipatiā, che presentano una identica sequenza che codifica per la porzione del BCR che lega lāantigene nota come ācomplementarity determining regionā (CDR) (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008; Ghiotto F et al, 2004; Tobin G et al, 2004) .Ā Vista la complessitĆ degli eventi di ricombinazione che portano allāassemblaggio del BCR, la probabilitĆ che due linfociti B normali possano avere casualmente un BCR stereotipato ĆØ dellāordine di 10-12, mentre ĆØ stato osservato che fino al 30 % dei casi di LLC puĆ² mostrare questo fenomeno (Stamatopoulos K et al, 2007). Tra gli antigeni in grado di ingaggiare il BCR nella LLC si annoverano gli elementi polisaccaridici batterici, il fattore reumatoide, il DNA, la cardiolipina, antigeni espressi sulle cellule apoptotiche (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008). Si ĆØ cosƬ affermato in questi ultimi anni il concetto di una relazione patogenetica tra stimolazione antigenica, spesso sostenuta da autoantigeni, e LLC17. In effetti ĆØ stata fornita una recente elegante dimostrazione di come una proteina, nota come ācatena pesante della miosina non-muscolareā (non muscle myosin heavy chain), avente un ruolo nel movimento cellulare, possa essere esposta sulla superficie delle cellule apoptotiche e di come la maggior parte della LLC ānon-mutateā possa riconoscere tramite i suoi anticorpi questo antigene (Chu CC et al, 2010).
Esiste inoltre dimostrazione che il linfocito della LLC puĆ² mantenere la capacitĆ di rispondere allāantigene a) andando incontro in vivo a switch di classe Ig (Malisan F et al, 1996) b) sviluppando nuove mutazioni del gene IGHV (Gurrieri C et al, 2002), c) esprimendo lāenzima AID (Oppezzo P et al, 2003), importante nel processo di ipermutazione somatica; d) modificando il profilo di espressione genica e attivando il ciclo cellulare (Guarini A et al, 2008).Ā Eā interessante notare che queste caratteristiche sono piĆ¹ spiccate nei casi di LLC ānon-mutateā CD38+ e ZAP-70+, rispetto alle altre LLC (Lanham S et al, 2003; Chen L et al, 2002).Ā In effetti, nelle LLC ānon-mutateā, il BCR-signaling ĆØ attivo, mentre nelle forme āmutateā ĆØ inattivo in seguito ad uno stato di anergia funzionale legato ad una protratta stimolazione antigenica, con conseguente desensibilizzazione del BCR stesso (Stevenson FK et al, 2004).Ā Questa condizione di āanergiaā si associa ad uno specifico profilo di espressione di geni coinvolti nel signaling BCR-mediato (Muzio M et al, 2008).
Il BCR signaling derivante dalla stimolazione antigenica comporta il coinvolgimento di una serie di molecole che regolano la vita del linfocito neoplastico (Burger JA, 2011). Alcune di queste molecole quali la Bruton tirosin chinasi (BTK) e la subunitĆ delta della fosfatidil-inositol-3 chinasi (PI3K delta), rappresentano bersagli per terapie mirate di dimostrata efficacia (FoĆ R et al, 2013).
Recentemente ĆØ stata inoltre dimostrata la capacitĆ , esclusiva dei BCRs dei linfociti neoplastici in corso di LLC, di attivare la cascata di segnalazione intracellulare indipendentemente da una stimolazione antigenica (DĆ¼hren-von Minden M et al, 2012). Questa proprietĆ sembra essere strettamente dipendente dallāinterazione delle regioni HCDR3 dei BCRs dei linfociti leucemici con specifici epitopi intrinseci degli stessi BCRs. Presumibilmente solo alcune sequenze HCDR3 e alcuni specifici epitopi intrinseci hanno questa peculiaritĆ , il che potrebbe giustificare la selezione di un ristretto repertorio di BCRs ed il fenomeno dei recettori stereotipati. Pur non escludendo il probabile contributo di una selezione antigenica specifica, questa ipotesi fornisce una spiegazione alternativa, antigene-indipendente, del fenomeno, ed individua un potenziale nuovo target terapeutico nellāinibizione del signalling autonomo del BCR in pazienti con LLC (DĆ¼hren-von Minden M et al, 2012).
c) Turn-over cellulare
Ā Contrariamente a quanto ritenuto nel recente passato, la LLC non puĆ² essere oggi considerata una patologia da accumulo di linfociti che non vanno incontro ad apoptosi. I linfociti patologici mantengono la sensibilitĆ ad alcuni stimoli pro-apoptotici mediati da Fas e dal legame di anticorpi anti IgM che ingaggiano il BCR (Chu P et al, 2002; Zupo S et al, 2002) e proliferano in vivo ad un ritmo pari allo 0,1-1% dellāintero clone ogni giorno (Messmer BT et al, 2005). Il ritmo di divisione cellulare e di rinnovo ĆØ piĆ¹ elevato nella frazione cellulare CD38+ (Calissano C et al, 2009).
d) Interazioni con il microambiente
Nei linfonodi dei soggetti con LLC esiste un comparto di āaccumuloā costituito da piccoli linfociti ed un comparto, quello dei ācentri di proliferazioneā, ricco in paraimmunoblasti e prolinfociti, ove le cellule mostrano i caratteri dellāattivazione e vanno incontro a divisione cellulare. Queste strutture istologiche, che conferiscono un quadro pseudofollicolare al linfonodo della LLC, si rinvengono anche nei tessuti infiammati dei soggetti affetti da patologia autoimmune (Humby F et al, 2009) e richiamano il concetto del ruolo della stimolazione da parte di autoantigeni nella genesi della LLC. Nei centri di proliferazione i prolinfociti e i paraimmunoblasti sono a stretto contatto con linfociti T CD4 e cellule follicolari dendritiche. Nel comparto di āaccumuloā i piccoli linfociti interagiscono con cellule stromali mesenchimali e con cellule ānutriciā (ānurselike cellsā) differenziatesi da monociti circolanti, in un contesto di interazioni cellula-cellula che ne favorisce la sopravvivenza.Ā In effetti, la stimolazione da parte del CD40 ha un ruolo nel mantenimento in vita del clone B-linfocitario, al pari dellāinterazione con i linfociti T CD4, in grado di determinare la produzione di citochine anti-apoptotiche (IL4, IFN) (Ghia P, Caligaris-Cappio F, 2000). Lāimportanza in vivo della presenza dei linfociti T CD4 ĆØ stata recentemente dimostrata in un modello murino immunodeficiente, in cui il trasferimento di cellule LLC dava origine alla malattia solo in presenza di linfociti T CD4 autologhi (Bagnara D et al, 2011). Le cellule T sono reclutate nel microambiente tumorale da chemochine prodotte dalle cellule leucemiche e ne favoriscono la sopravvivenza tramite interazioni cellulari, in particolare il legame CD40-CD40L. Le cellule leucemiche esprimono inoltre recettori inibitori e producono molecole solubili in grado di rendere inefficace lāattivitĆ delle cellule T CD4, CD8 ed NK e sfuggire cosƬ alla sorveglianza immunitaria (ten Hacken E, Burger JA, 2014)
Nella distribuzione e sopravvivenza delle cellule patologiche (Stevenson FK, Caligaris-Cappio F, 2004) giocano un ruolo importante a) alcune chemochine e loro recettori, espressi dal linfocito leucemico (CXCR3 e CXCR5), b) cellule del sangue periferico in grado di differenziarsi in cellule ānutriciā (ānurselikeā), che favoriscono la sopravvivenza e la migrazione del linfocito allāinterno degli spazi midollari attraverso lo stromal-derived growth factor (Burger JA et al,1999), c) le cellule dendritiche, attraverso il CD44 e grazie allāinduzione dellāespressione di una proteina BCL2 correlata (Mcl-1) (Pedersen IM et al, 2002).Ā Lāangiogenesi puĆ² giocare un ruolo nelle fasi di accelerazione della malattia o nei sottogruppi piĆ¹ aggressivi, ove si riscontrano livelli serici piĆ¹ elevati di VEGF (Molica S et al, 2002; Maffei R et al, 2010).
e) Lesioni citogenetico-molecolari
– geni microRNA e TCL1
Nella LLC non ĆØ ad oggi nota la lesione genetica primaria in grado di innescare il processo di trasformazione, ma sono disponibili numerose informazioni su una serie di lesioni che governano il processo di trasformazione (Figura II).
Figura II. Stimolazione antigenica e lesioni citogenetico-molecolari nella patogenesi della LLC
Sono stati localizzati due geni codificanti per microRNA (i.e miR-15 e miR-16) nella regione 13q14, deleta in un 40-50% delle LLC. Questi geni mostrano ridotta espressione in seguito a delezione nella LLC (Calin GA et al, 2002) e, in queste condizioni, puĆ² risultare alterata lāespressione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei linfociti B, in particolare il gene antiapoptotico BCL-2. In effetti, la delezione di miR-15 e miR-16 nel topo determina lāinsorgenza di unāespansione clonale di linfociti B che presenta le caratteristiche biologiche della LLC. La proliferazione linfoide ĆØ piĆ¹ marcata e aggressiva se la delezione coinvolge, oltre ai suddetti geni a microRNA, il gene DLEU2 che mappa nella stessa regione (Klein U et al, 2010).Ā La concomitante delezione di DLEU7, posizionato allāinterno della regione di minima delezione, puĆ² contribuire alla patogenesi per la perdita/riduzione della sua fisiologica funzione di inibizione di NF-kB (Palamarchuk A et al, 2010).
Nella LLC, inoltre, vi ĆØ una consistente overespressione del geneĀ TCL1 che mappa a livello della banda 14q32.1, determinata da un meccanismo di demetilazione del promotore (Yuille MR et al, 2001) e/o da due geni a microRNA, miR-29 and miR-181 (Efanov A et al, 2010).Ā Esiste la documentazione che il topo transgenico per un costrutto che contiene lāenhancer del gene Ig ed il geneĀ TCL1 sviluppa unāespansione clonale B-CD5+, che con il passare del tempo assume le caratteristiche della LLC (Bichi R et al, 2002).Ā Analogamente, il topo transgenico che iperesprime miR-29 nei linfociti B, puĆ² sviluppare la LLC (Santanam U et al, 2010).Ā Il ruolo diĀ TCL1Ā nella patogenesi della LLC ĆØ mediato dalla riduzione dellāattivitĆ della DNA metiltansferasi 3A con conseguente diminuzione della metilazione del DNA (Palamarchuk A et al, 2012).
La famiglia dei miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) risulta frequentemente ipoespressa nella LLC. Questi geni a miRNA sono target trascrizionali diretti di p53 e sono coinvolti nel pathways dellāapoptosi p53-mediata. Ridotti livelli di miR-34, associati o meno a del17p/ mutazione TP53 o a delezione 11q (ove sono situati i geni che codificano per miR-34b e miR34c) si associano a forme di malattia piĆ¹ aggressiva (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Il profilo di espressione di numerosi altri miRNA (tra i quali miR21, miR181, miR155) riveste un ruolo prognostico nella LLC (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Studi recenti hanno dimostrato come diversi microRNA siano implicati a vario livello anche nella via di segnalazione del BCR e nelle interazioni con il microambiente (Balatti V et al, 2015), con un ruolo di regolazione della proliferazione e apoptosi delle cellule leucemiche che viene attualmente studiato come possibile target terapeutico (Bottoni A et al, 2016).
– Mutazioni geniche ricorrenti
Il sequenziamento del genoma di pazienti affetti da LLC (Puente XS et al, 2011; Fabbri G et al, 2011)
ha dimostrato che la LLC si associa a mutazioni di tipo non-silente di numerosi geni, in grado di alterare la funzione delle corrispondenti proteine. Queste mutazioni appaiono piĆ¹ frequenti delle lesioni che comportano perdita o guadagno di materiale genico e sono in genere variabili da paziente a paziente pur potendosi individuare alcuni pathways comunemente coinvolti: regolazione del ciclo cellulare e apoptosi, risposta al danno del DNA, processazione del RNA, vie di segnalazione intracellulare (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). Alcune di queste lesioni sono ricorrenti:
- Regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno del DNA: oltre alle lesioni diĀ TP53,Ā trattate nel paragrafo 17p-, e di ATM, trattate nel paragrafo 11q-, tra i geni coinvolti nella riparazione/protezione del DNA ĆØ risultato mutato in maniera ricorrente POT1, codificante una componente del sistema di mantenimento dei telomeri e mutato in circa il 3% dei pazienti con LLC, tutti appartenenti al sottogruppo con IGHV non mutato (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
- Vie di segnalazione intracellulare: le lesioni diĀ NOTCH1,Ā presenti nel 10-15% dei casi, comportano lāaccumulo di unāisoforma attiva della proteina che ĆØ in grado attivare il signalling intracellulareĀ NOTCH1-correlato.Ā I pazienti con questa mutazione presentano in genere una malattia relativamente aggressiva, associata al frequente sviluppo di farmacoresistenza e alla possibile tendenza allāevoluzione in sindrome di Richter . Le mutazioni diĀ NOTCH1Ā sono piĆ¹ frequenti nei pazienti conĀ IGHV non mutato e con la trisomia 12 (Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012).
- Oltre alla mutazione del gene stesso, multiple lesioni genetiche ricorrenti in pazienti con LLC sembrano convergere sullāattivazione della via di NOTCH1, in particolare la mutazione inattivante di FBXW7, il cui prodotto interviene nella degradazione della proteina NOTCH1, e una mutazione nella regione non codificante 3ā UTR di NOTCH1 che ne altera lo splicing (Puente XS et al, 2015; Fabbri G et al, 2016). Lāeffettiva incidenza della deregolazione della via di NOTCH1 nella LLC potrebbe quindi essere sottostimata.
- Diverse mutazioni ricorrenti nella LLC si traducono invece nellāattivazione del complesso trascrizionale NF-kB. BIRC3 codifica per una proteina che down-regola il signalling di NF-ĪŗB e presenta mutazioni inattivanti nel 20% circa delle LLC chemio-refrattarie. La frequenza di queste mutazioni ĆØ bassa (<5%) nelle fasi iniziali della malattia (Rossi D et al, 2012). Le lesioni di MYD88,Ā rinvenute nel 5% dei casi e con maggior frequenza nelle LLC con geniĀ IGHVmutati,Ā comportano la deregolazione di multipli pathways di segnalazione intracellulare con attivazione di target diversi tra cui NF-kB e STAT3 (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). In una piccola frazione di pazienti (1-3%), accomunati da un decorso aggressivo, risulta invece inattivato il gene NFKBIE che codifica un regolatore negativo diretto (IkBe) di NF-kB (Mansouri L et al, 2015).
- Processazione RNA: Nel 5% delle LLC alla diagnosi si ritrovano mutazioni del geneĀ SF3B1, che codifica per una proteina coinvolta nello splicing del RNA. Le conseguenze della mutazione di SF3B1 nella patogenesi della LLC sono state recentemente studiate con unāanalisi trascrittomica che ha dimostrato lāalterazione di meccanismi di riparazione del DNA, di mantenimento delle sequenze telomeriche e, nuovamente, del signalling di NOTCH1 (Wang L et al, 2016). Queste mutazioni sono piĆ¹ frequenti nelle LLC con 11q- (Wang L et al, 2011),Ā si associano ad uno stadio piĆ¹ avanzato, allo stato non mutato dei geniĀ IGHVĀ e alla positivitĆ per ZAP70 (Quesada V et al, 2011).Ā Anche questa lesione, al pari delle mutazioni diĀ NOTCH1Ā si rinviene piĆ¹ frequentemente nelle LLC chemiorefrattarie (Rossi D et al, 2011).
Eā interessante notare come le mutazioni diĀ TP53,Ā NOTCH1,Ā SF3B1Ā eĀ BIRC3Ā siano nella maggior parte dei casi mutualmente esclusive nei casi di LLC refrattari alla fludarabina, per cui ĆØ ragionevole ipotizzare che oltre aĀ TP53, le vie del signaling di NOTCH1 ed NF-ĪŗB e il sistema dello splicing possano giocare un ruolo indipendente nella genesi della chemiorefrattarietĆ .
Il progresso delle tecniche di sequenziamento del DNA (next generation sequencing) ne ha consentito lāapplicazione su grandi coorti di pazienti (Puente XS et al, 2015; Landau DA et al, 2015). Il sequenziamento dellāintero genoma codificante in 538 casi di LLC (Landau DA et al, 2015) ha individuato mutazioni ricorrenti a carico di due ulteriori pathways con ruolo patogenetico importante: i geni PTPN11 e FUBP1 sono modulatori dellāattivitĆ di MYC, mentre le mutazioni di NRAS, KRAS e BRAF implicano il coinvolgimento della via di segnalazione MAPK-ERK. Le lesioni ricorrenti di RPS15, coinvolto nel processo di splicing, e di IKZF3, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dei linfociti B, si sono rivelate mutazioni ādriverā precedentemente non note nella patogenesi della malattia (Landau DA et al, 2015). Un dato estremamente interessante ĆØ emerso dal sequenziamento su larga scala (506 pazienti) anche delle regioni non codificanti del genoma dei casi di LLC, con lāidentificazione di mutazioni ricorrenti in queste sequenze in grado di modificare lāespressione di geni codificanti. Le piĆ¹ rilevanti sono la mutazione ricorrente della regione 3ā UTR di NOTCH1, che ne altera il processo di splicing con delezione del dominio PEST e incremento della stabilitĆ della proteina, e la mutazione a carico di una regione enhancer del cromosoma 9p13, che si associa ad una ridotta espressione del fattore di trascrizione PAX5, essenziale nel differenziamento B-linfocitario (Puente XS et al, 2015).
–Ā Telomeri
I telomeri sono costituiti da sequenze ripetute di DNA che conferiscono stabilitĆ alla struttura dei cromosomi. Con lāinvecchiamento della cellula ed in seguito ai cicli replicativi a cui questa va incontro si assiste ad un accorciamento dei telomeri, che viene normalmente limitato dallāattivitĆ delle telomerasi.Ā Nella LLC i telomeri
dei linfociti patologici sono piĆ¹ corti rispetto ai linfociti B normali di soggetti di pari etĆ e sesso.Ā Inoltre lāaccorciamento dei telomeri ĆØ piĆ¹ spiccato nelle LLC ānon-mutateā, nelle quali si rinviene anche una maggiore attivitĆ telomerasica (Damle RN et al, 2004; Grabowski P et al, 2005) e si associa ad una prognosi sfavorevole e ad unāaumentata probabilitĆ di sviluppare la sindrome di Richter
(Rossi D et al, 2009).Ā Queste osservazioni indicano come la storia replicativa della LLC sia differente a seconda dello stato mutazionale dei geni Ig e come nei casi piĆ¹ aggressivi vi sia stato uno stimolo proliferativo nelle fasi di emergenza del clone neoplastico in grado di indurre numerosi cicli di attivazione e replicazione con accorciamento, disfunzione e fusione dei telomeri e conseguente insorgenza di esteso danno del genoma (Lin TT et al, 2010).
Un recente lavoro di sequenziamento del genoma in pazienti con LLC familiare ha dimostrato la presenza di mutazioni germline proprio a carico di geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri (in particolare POT1), sottolineando come la disregolazione di questi fini meccanismi di protezione del DNA svolga un ruolo chiave nella patogenesi della LLC (Speedy HE et al, 2016).
Anomalie citogenetiche
Lāintroduzione della FISH ha permesso lāindividuazione di aberrazioni cromosomiche in circa lā80% dei casi di LLC e ogni paziente viene oggi incluso in uno specifico gruppo in base a una classificazione citogenetica gerarchica che attribuisce importanza decrescente alle seguenti lesioni: 17p- > 11q- > +12 > 13q-. I risultanti gruppi citogenetici hanno una frequenza diversa a seconda dello stadio di malattia, come riportato in Tabella II.
Tabella II. Frequenza (% di casi) di aberrazioni cromosomiche alla FISH, di lesioni genetiche e stato mutazionale IGHV in >4000 casi di LLC arruolati nei protocolli del GCLLSG (*)
Recentemente, lāintroduzione di una stimolazione efficace delle mitosi mediante oligonucleotidi e IL2 ha mostrato che approssimativamente il 30% delle LLC senza difetti cromosomici mediante analisi FISH in interfase puĆ² presentare una lesione cromosomica nel cariotipo allāanalisi citogenetica e come questi pazienti āFISH normaliā con anomalie citogenetiche nel cariotipo abbiano una prognosi sfavorevole (Rigolin GM et al, 2012).Ā Inoltre, ĆØ stato dimostrato con questa tecnica che cariotipi complessi potevano essere documentati in una significativa frazione dei casi in associazione con fattori prognostici e quadro clinico sfavorevole (Haferlach C et al, 2007; Rigolin GM et al, 2015). Un quadro riassuntivo del significato delle principali lesioni citogenetiche ĆØ presentato in Tabella III.
Tabella III: Significato clinicobiologico dei difetti cromosomici ricorrenti nella LLC
Nuove sottili aberrazioni sono state identificate mediante sensibilissime tecniche di scansione dellāintero genoma, grazie alla quale sono state documentate lesioni genetiche in virtualmente tutti i casi di LLC (Grubor V et al, 2009).
13q-
A cura di: Danilo G. Faraci, Antonio Cuneo, Ematologia, UniversitĆ di Ferrara
La delezione 13q14 ĆØ la piĆ¹ frequente anomalia citogenetica nella LLC e viene identificata alla FISH in piĆ¹ del 50% dei casi. Questa delezione ĆØ stata descritta come eterozigote in approssimativamente il 75-80% dei casi e omozigote nel restante 20-25%. Studi molecolari hanno dimostrato che la regione comunemente deleta comprende 790 kb tra i marcatori D13S1150 e D13S25.
Pekarsky et al (Pekarsky Y e Croce CM, 2015) hanno individuato tra i geni target della delezione 13q14, un cluster di 30 kb tra gli esoni 2 e 5 del gene DLEU2 codificante per due microRNA (miR-15a/miR-16-1) in grado di regolare la funzione di molteplici oncogeni, principale dei quali risulta essere BCL-2. Tale proteina, nella maggioranza dei casi di LLC, risulta overespressa, facendo intendere pertanto la funzione oncosoppressoria di miR-15a e miR-16-1. La delezione di questi geni per microRNA ĆØ stata recentemente confermata da altri ricercatori che hanno utilizzato CGH array ad alta risoluzione in 58 casi di LLC (Buhl AM et al, 2006).
Nel 2010, Klein et al (Klein U et al, 2010) hanno evidenziato che, se nel topo transgenico la delezione ĆØ ampia, coinvolgendo sia il cluster miR-15/16-1 che altri loci mappati su DLEU2, anche la malattia assume un decorso piĆ¹ grave, con una proliferazione linfoide piĆ¹ marcata ed aggressiva.
La categoria di pazienti che non presentano altre anomalie cromosomiche associate alla delezione 13q14 ĆØ quella a prognosi piĆ¹ favorevole con intervallo tra diagnosi e inizio del trattamento e sopravvivenza superiori rispetto alla LLC con cariotipo normale.
Tuttavia alcune differenze in termini di predittivitĆ del decorso clinico sono state osservate in rapporto a, i) delezione eterozigorte o omozigote, ii) grandezza del clone con delezione, iii) ampiezza delle delezione.
Garg R et al, 2012 hanno dimostrato che i pazienti con delezione eterozigote e quelli con delezione omozigote presentano un andamento clinico sovrapponibile. Tale evidenza smentirebbe precedenti ipotesi secondo le quale i pazienti omozigoti potrebbero presentare una maggiore cinetica di crescita linfocitaria rispetto agli eterozigoti.
Individui con unāalta percentuale di cellule con nuclei deleti sembrano avere un decorso piĆ¹ aggressivo della malattia, rientrando a tutti gli effetti nella categoria di rischio citogenetico intermedio (Van Dyke DL et al, 2010).
Dal Bo et al (Dal Bo M et al, 2011) hanno stabilito come cut-off il 70% di nuclei del clone con delezione 13q14, e hanno diviso i casi di LLC del loro studio in quattro sottogruppi: pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1, pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, e pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1. Di questi, solo il primo gruppo manteneva una prognosi favorevole, mentre gli altri tre presentavano un decorso clinico simile alla LLC con cariotipo normale, con diminuzione di TFT e OS. La delezione di oltre il 70% di nuclei delle cellule del clone appare quindi come un marker indipendente di progressione, con impatto maggiore rispetto allāampiezza della delezione stessa. Tale dato veniva confermato da Van Dyke et al (Van Dyke DL et al, 2016), (dimostrando che i pazienti aventi >85% nuclei 13q- presentano unāevoluzione clinica peggiore, con TFT sovrapponibile a quelli aventi cariotipo normale o trisomia 12.
La minima regione deleta (MDR) del 13q include i loci DLEU2/MIR15A/MIR161, mentre nei casi con ampia delezione il segmento perso puĆ² comprendere anche il gene RB1 (banda 13q14.1-q14.2). Xiong et al (Xiong W et al, 2015) hanno dimostrato, mediante lāutilizzo di sonde specifiche per MDR e RB1 alla FISH, che i pazienti aventi unāampia delezione presentano TFT e OS nettamente piĆ¹ brevi rispetto ai pazienti aventi minima delezione. Tale dato veniva invece contraddetto dai ricercatori canadesi della British Columbia, i quali hanno evidenziato almeno 9 possibili combinazioni di delezione 13q14 a seconda dei geni deleti e della presenza dellāalterazione in entrambi gli alleli o meno. PiĆ¹ comunemente lāampia delezione risulta monoallelica (55%), fattore che potrebbe spiegare lāimpatto non significativo del coinvolgimento del gene RB1 nellāoutcome dei pazienti (Huang SJ et al, 2016). Pure Haferlach et al (Haferlach C et al, 2012) hanno dimostrato che lāampia delezione non influisce negativamente sul TFT. Data la discrepanza dei risultati ottenuti finora dai diversi studi, pertanto il significato prognostico dellāampiezza della delezione 13q14 risulta poco chiaro e rimane ad oggi unāinteressante questione scientifica.
In conclusione, il gruppo di pazienti con 13q- isolata parrebbe essere non omogeneo, in quanto recenti studi hanno messo in evidenza che la percentuale di cellule del clone che presentano nuclei deleti sia in grado di influenzare il decorso e la prognosi della malattia, con la conseguente necessitĆ di ridefinirne il rischio in base a tale parametro. Per quanto riguarda lāampiezza della delezione stessa, ulteriori studi sono necessari. Risulta evidente che lāimplicazione clinica della delezione 13q14 assume quindi un significato piĆ¹ complesso di quanto originariamente attribuitogli.
INTRODUZIONE
Rispetto alla visione storica che definiva la leucemia linfatica cronica (LLC) una malattia indolente da accumulo di piccoli linfociti, le conoscenze patogenetiche hanno consentito di riconoscere questa condizione come una malattia dinamica, che trae la sua origine da una ricca serie di eventi biologici e genetici primari e secondari. Lāinterazione con gli antigeni, lo stato di āattivazioneā cellulare che ne segue e le complesse interazioni con il microambiente plasmano una malattia dal decorso eterogeneo, talora preceduta da una condizione predisponente, la linfocitosi B-monoclonale (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL) recentemente definita nei suoi contorni nosografici. Grazie ai progressi sulla comprensione dei meccanismi che governano la storia naturale della LLC lāapproccio moderno alla gestione del paziente si avvale di una caratterizzazione clinica che prevede lo studio di una serie di marcatori prognostici, molto utili per lāadeguata programmazione di terapie sempre piĆ¹ efficaci, che includono oggi alcune molecole in grado di interferire con processi essenziali per la sopravvivenza e la crescita del linfocito neoplastico.
Definizione e cenni epidemiologici
La LLC ĆØ un disordine linfoproliferativo cronico che coinvolge i linfociti B CD5-positivi e che rientra tra le neoplasie a cellule B-mature della classificazione WHO (Muller-Hermelink HK et al, 2008). Eā piĆ¹ frequente nei maschi che nelle femmine (1,5-2,0/1), ed ha unāincidenza nei paesi occidentali, riferita a 100.000 abitanti, compresa tra 2-6 casi/anno, mentre ĆØ rara in Giappone e nei paesi orientali, ove lāincidenza ĆØ <1 caso/100.000 abitanti (Redaelli A et al, 2004) (Figura Ia).
LāetĆ media alla diagnosi ĆØ attorno ai 70 anni, e lāincidenza aumenta da 1 caso/anno/100.000 abitanti nella fascia 40-50 anni a 20 casi nella fascia 70-80 anni. Oltre il 40% delle LLC ĆØ diagnosticata ad unāetĆ >75 anni, mentre meno del 10% ĆØ diagnosticata prima dei 50 anni (Brenner H et al, 2008) (Figura Ib).
Figura I. a) incidenza nei diversi paesi; b) incidenza per etĆ
Eziologia
Lāeziologia della LLC non ĆØ nota. Non puĆ² essere escluso un ruolo per le radiazioni ionizzanti (Richardson DB et al, 2005), anche se lo studio della popolazione sopravvissuta allāincidente nucleare di Chernobyl ha mostrato un aumento di incidenza di molte forme di leucemia, ma non di LLC (Lin SL et al, 2009). Alcune attivitĆ agricole, con particolare riguardo allāimpiego di pesticidi si possono associare ad un aumento dei casi di LLC (Caporaso N et al, 2004).
Vi ĆØ evidenza di una possibile associazione tra LLC e fattori genetici. La LLC ha unāincidenza bassa nelle popolazioni orientali rispetto agli occidentali e i gruppi etnici che migrano in altri paesi mantengono lāincidenza di questa malattia al livello di quella del paese di provenienza.Ā Nei parenti di primo grado di soggetti affetti da LLC il rischio di sviluppo della malattia e di altre sindromi linfoproliferative (linfoma di Hodgkin e non Hodgkin) ĆØ superiore rispetto a quello della popolazione generale di pari etĆ e sesso (Capalbo S et al, 2000; Goldin LR et al, 2004) e si possono rinvenire espansioni di piccoli cloni B linfocitari con fenotipo classico della LLC e negativitĆ per CD38, con una frequenza francamente maggiore rispetto alla popolazione generale (Rawstron AC et al, 2002). In unāanalisi di 24 famiglie con piĆ¹ di due membri affetti si ĆØ potuto documentare, accanto alle classiche anomalie citogenetiche, una elevata frequenza di delezioni o guadagno di materiale genetico a livello delle bande Xp11.1-p21, Xq21-qter, 2p12-14 e 4q11-21 (Martin AJ et al, 2002).Ā Eā possibile che, diversamente dal cancro mammario, ove un gene (BRCA1) ha un importantissimo effetto, il substrato genetico della LLC consista nellāintervento di piĆ¹ geni con basso potenziale predisponente (Goldin LR et al, 2007).
Patogenesi
A cura di: Sara Martinelli (Struttura semplice di Ematologia- UnitĆ operativa di Medicina Interna – Ospedale S. Chiara di Trento).
La patogenesi della LLC riconosce numerosi momenti (Tabella I), incentrati sulle particolaritĆ della cellula dāorigine, sulle sue interazioni con ipotetici antigeni e con il microambiente e sullo sviluppo di una vasta gamma di lesioni genetiche.
Tabella I: Momenti patogenetici nella LLC
a) Cellula dāorigine
Per molto tempo lāespressione del CD5 da parte delle cellule della LLC ha fatto ritenere che la controparte cellulare normale fosse rappresentata dal subset di linfociti B-1 (definito nel topo, senza un chiaro corrispettivo nellāuomo), coinvolto nellāimmunitĆ innata e in grado di produrre anticorpi naturali mediante una reazione T-indipendente (Darzentas N et al, 2010). Nellāuomo, lāespressione di CD5 caratterizza le cellule B vergini, mentre viene persa dopo lāincontro con lāantigene. In una parte dei casi di LLC (50-80% nelle varie casistiche) la cellula leucemica presenta >2% di mutazioni somatiche nella sequenza del gene codificante per la porzione variabile delle catene pesanti delle Ig (IGHV), un processo (ipermutazione somatica) che fisiologicamente avviene allāinterno del centro germinativo, grazie allāintervento di enzimi quali lāactivation-induced cytidine deaminase (AID), in risposta ad antigeni T-dipendenti. La restante parte delle LLC presenta una configurazione āgermlineā della porzione variabile del gene Ig (i.e. <2% di mutazioni). Il passaggio attraverso il centro germinativo, che quindi caratterizza le LLC āmutateā, ĆØ tuttavia incompatibile con la derivazione dai linfociti B-1. Inoltre, lo studio del profilo di espressione genica ha mostrato ampia omogeneitĆ tra i diversi casi di LLC, indipendentemente dallo stato mutazionale dei geni IGHV, ed ĆØ risultato somigliante a quello delle cellule B memoria CD27+. I casi di LLC āmutateā potrebbero quindi rappresentare lāespansione di cellule B memoria CD27+ che, in seguito allāincontro con un antigene T-dipendente, hanno attraversato le fasi del centro germinativo; i casi di LLC ānon mutateā potrebbero invece derivare da una frazione minoritaria di cellule B CD27+ che hanno incontrato lāantigene in maniera T-indipendente ed hanno sviluppato un fenotipo āmemoriaā senza passaggio attraverso il centro germinativo (Klein U et al, 2001; Rosenwald A et al, 2001). Lāespressione del CD5 potrebbe essere coerente con lāorigine delle LLC āmutateā da un subset recentemente riconosciuto di cellule B memoria CD27+ CD5+, mentre per le LLC ānon mutateā lāespressione del CD5 sarebbe suggestiva di una origine da cellule B vergini pre-centro germinativo, ipotesi sostenuta anche da alcuni studi di espressione genica (Seifert M et al, 2012), non potendo tuttavia escludere che il fenotipo di superficie possa essere stato alterato dal processo stesso di trasformazione o da uno stato di anomala attivazione e che quindi il CD5 sia comunque espresso da cellule che hanno effettivamente incontrato lāantigene (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
Accanto alle controversie relative allāorigine della cellula B matura la cui espansione determina la malattia, recenti evidenze suggeriscono che le piĆ¹ precoci alterazioni genetiche ed epigenetiche che predispongono allo sviluppo della LLC si verifichino a monte, a livello della cellula staminale emopoietica pluripotente (HSCs). Per effetto di queste lesioni precoci, la cui natura non ĆØ al momento chiara, il destino di questi progenitori viene orientato verso il lineage B linfocitario, con successiva selezione, per effetto della stimolazione antigenica, di elementi maturi della loro progenie che vanno incontro ad unāespansione prima oligoclonale, quindi monoclonale per accumulo di ulteriori lesioni genetiche (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
b) Ruolo della stimolazione antigenica
Eā noto che il clone trasformato nella LLC presenta un utilizzo preferenziale di alcune famiglie V, D e J (ad esempio VH1-69; VH4-34), che non riflette la frequenza di questi riarrangiamenti nella popolazione B-linfocitaria CD5 normale. PoichĆ© queste sequenze, assemblate durante la maturazione B-linfocitaria intramidollare, formano la porzione variabile del gene Ig espressa in superficie come BCR, si puĆ² dedurre che alcuni antigeni sono in grado di ingaggiare i cloni esprimenti questi BCR favorendone lāespansione e la successiva trasformazione. Questo concetto ĆØ stato rafforzato dalla dimostrazione di āBCR stereotipatiā, che presentano una identica sequenza che codifica per la porzione del BCR che lega lāantigene nota come ācomplementarity determining regionā (CDR) (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008; Ghiotto F et al, 2004; Tobin G et al, 2004) .Ā Vista la complessitĆ degli eventi di ricombinazione che portano allāassemblaggio del BCR, la probabilitĆ che due linfociti B normali possano avere casualmente un BCR stereotipato ĆØ dellāordine di 10-12, mentre ĆØ stato osservato che fino al 30 % dei casi di LLC puĆ² mostrare questo fenomeno (Stamatopoulos K et al, 2007). Tra gli antigeni in grado di ingaggiare il BCR nella LLC si annoverano gli elementi polisaccaridici batterici, il fattore reumatoide, il DNA, la cardiolipina, antigeni espressi sulle cellule apoptotiche (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008). Si ĆØ cosƬ affermato in questi ultimi anni il concetto di una relazione patogenetica tra stimolazione antigenica, spesso sostenuta da autoantigeni, e LLC17. In effetti ĆØ stata fornita una recente elegante dimostrazione di come una proteina, nota come ācatena pesante della miosina non-muscolareā (non muscle myosin heavy chain), avente un ruolo nel movimento cellulare, possa essere esposta sulla superficie delle cellule apoptotiche e di come la maggior parte della LLC ānon-mutateā possa riconoscere tramite i suoi anticorpi questo antigene (Chu CC et al, 2010).
Esiste inoltre dimostrazione che il linfocito della LLC puĆ² mantenere la capacitĆ di rispondere allāantigene a) andando incontro in vivo a switch di classe Ig (Malisan F et al, 1996) b) sviluppando nuove mutazioni del gene IGHV (Gurrieri C et al, 2002), c) esprimendo lāenzima AID (Oppezzo P et al, 2003), importante nel processo di ipermutazione somatica; d) modificando il profilo di espressione genica e attivando il ciclo cellulare (Guarini A et al, 2008).Ā Eā interessante notare che queste caratteristiche sono piĆ¹ spiccate nei casi di LLC ānon-mutateā CD38+ e ZAP-70+, rispetto alle altre LLC (Lanham S et al, 2003; Chen L et al, 2002).Ā In effetti, nelle LLC ānon-mutateā, il BCR-signaling ĆØ attivo, mentre nelle forme āmutateā ĆØ inattivo in seguito ad uno stato di anergia funzionale legato ad una protratta stimolazione antigenica, con conseguente desensibilizzazione del BCR stesso (Stevenson FK et al, 2004).Ā Questa condizione di āanergiaā si associa ad uno specifico profilo di espressione di geni coinvolti nel signaling BCR-mediato (Muzio M et al, 2008).
Il BCR signaling derivante dalla stimolazione antigenica comporta il coinvolgimento di una serie di molecole che regolano la vita del linfocito neoplastico (Burger JA, 2011). Alcune di queste molecole quali la Bruton tirosin chinasi (BTK) e la subunitĆ delta della fosfatidil-inositol-3 chinasi (PI3K delta), rappresentano bersagli per terapie mirate di dimostrata efficacia (FoĆ R et al, 2013).
Recentemente ĆØ stata inoltre dimostrata la capacitĆ , esclusiva dei BCRs dei linfociti neoplastici in corso di LLC, di attivare la cascata di segnalazione intracellulare indipendentemente da una stimolazione antigenica (DĆ¼hren-von Minden M et al, 2012). Questa proprietĆ sembra essere strettamente dipendente dallāinterazione delle regioni HCDR3 dei BCRs dei linfociti leucemici con specifici epitopi intrinseci degli stessi BCRs. Presumibilmente solo alcune sequenze HCDR3 e alcuni specifici epitopi intrinseci hanno questa peculiaritĆ , il che potrebbe giustificare la selezione di un ristretto repertorio di BCRs ed il fenomeno dei recettori stereotipati. Pur non escludendo il probabile contributo di una selezione antigenica specifica, questa ipotesi fornisce una spiegazione alternativa, antigene-indipendente, del fenomeno, ed individua un potenziale nuovo target terapeutico nellāinibizione del signalling autonomo del BCR in pazienti con LLC (DĆ¼hren-von Minden M et al, 2012).
c) Turn-over cellulare
Ā Contrariamente a quanto ritenuto nel recente passato, la LLC non puĆ² essere oggi considerata una patologia da accumulo di linfociti che non vanno incontro ad apoptosi. I linfociti patologici mantengono la sensibilitĆ ad alcuni stimoli pro-apoptotici mediati da Fas e dal legame di anticorpi anti IgM che ingaggiano il BCR (Chu P et al, 2002; Zupo S et al, 2002) e proliferano in vivo ad un ritmo pari allo 0,1-1% dellāintero clone ogni giorno (Messmer BT et al, 2005). Il ritmo di divisione cellulare e di rinnovo ĆØ piĆ¹ elevato nella frazione cellulare CD38+ (Calissano C et al, 2009).
d) Interazioni con il microambiente
Nei linfonodi dei soggetti con LLC esiste un comparto di āaccumuloā costituito da piccoli linfociti ed un comparto, quello dei ācentri di proliferazioneā, ricco in paraimmunoblasti e prolinfociti, ove le cellule mostrano i caratteri dellāattivazione e vanno incontro a divisione cellulare. Queste strutture istologiche, che conferiscono un quadro pseudofollicolare al linfonodo della LLC, si rinvengono anche nei tessuti infiammati dei soggetti affetti da patologia autoimmune (Humby F et al, 2009) e richiamano il concetto del ruolo della stimolazione da parte di autoantigeni nella genesi della LLC. Nei centri di proliferazione i prolinfociti e i paraimmunoblasti sono a stretto contatto con linfociti T CD4 e cellule follicolari dendritiche. Nel comparto di āaccumuloā i piccoli linfociti interagiscono con cellule stromali mesenchimali e con cellule ānutriciā (ānurselike cellsā) differenziatesi da monociti circolanti, in un contesto di interazioni cellula-cellula che ne favorisce la sopravvivenza.Ā In effetti, la stimolazione da parte del CD40 ha un ruolo nel mantenimento in vita del clone B-linfocitario, al pari dellāinterazione con i linfociti T CD4, in grado di determinare la produzione di citochine anti-apoptotiche (IL4, IFN) (Ghia P, Caligaris-Cappio F, 2000). Lāimportanza in vivo della presenza dei linfociti T CD4 ĆØ stata recentemente dimostrata in un modello murino immunodeficiente, in cui il trasferimento di cellule LLC dava origine alla malattia solo in presenza di linfociti T CD4 autologhi (Bagnara D et al, 2011). Le cellule T sono reclutate nel microambiente tumorale da chemochine prodotte dalle cellule leucemiche e ne favoriscono la sopravvivenza tramite interazioni cellulari, in particolare il legame CD40-CD40L. Le cellule leucemiche esprimono inoltre recettori inibitori e producono molecole solubili in grado di rendere inefficace lāattivitĆ delle cellule T CD4, CD8 ed NK e sfuggire cosƬ alla sorveglianza immunitaria (ten Hacken E, Burger JA, 2014)
Nella distribuzione e sopravvivenza delle cellule patologiche (Stevenson FK, Caligaris-Cappio F, 2004) giocano un ruolo importante a) alcune chemochine e loro recettori, espressi dal linfocito leucemico (CXCR3 e CXCR5), b) cellule del sangue periferico in grado di differenziarsi in cellule ānutriciā (ānurselikeā), che favoriscono la sopravvivenza e la migrazione del linfocito allāinterno degli spazi midollari attraverso lo stromal-derived growth factor (Burger JA et al,1999), c) le cellule dendritiche, attraverso il CD44 e grazie allāinduzione dellāespressione di una proteina BCL2 correlata (Mcl-1) (Pedersen IM et al, 2002).Ā Lāangiogenesi puĆ² giocare un ruolo nelle fasi di accelerazione della malattia o nei sottogruppi piĆ¹ aggressivi, ove si riscontrano livelli serici piĆ¹ elevati di VEGF (Molica S et al, 2002; Maffei R et al, 2010).
e) Lesioni citogenetico-molecolari
– geni microRNA e TCL1
Nella LLC non ĆØ ad oggi nota la lesione genetica primaria in grado di innescare il processo di trasformazione, ma sono disponibili numerose informazioni su una serie di lesioni che governano il processo di trasformazione (Figura II).
Figura II. Stimolazione antigenica e lesioni citogenetico-molecolari nella patogenesi della LLC
Sono stati localizzati due geni codificanti per microRNA (i.e miR-15 e miR-16) nella regione 13q14, deleta in un 40-50% delle LLC. Questi geni mostrano ridotta espressione in seguito a delezione nella LLC (Calin GA et al, 2002) e, in queste condizioni, puĆ² risultare alterata lāespressione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei linfociti B, in particolare il gene antiapoptotico BCL-2. In effetti, la delezione di miR-15 e miR-16 nel topo determina lāinsorgenza di unāespansione clonale di linfociti B che presenta le caratteristiche biologiche della LLC. La proliferazione linfoide ĆØ piĆ¹ marcata e aggressiva se la delezione coinvolge, oltre ai suddetti geni a microRNA, il gene DLEU2 che mappa nella stessa regione (Klein U et al, 2010).Ā La concomitante delezione di DLEU7, posizionato allāinterno della regione di minima delezione, puĆ² contribuire alla patogenesi per la perdita/riduzione della sua fisiologica funzione di inibizione di NF-kB (Palamarchuk A et al, 2010).
Nella LLC, inoltre, vi ĆØ una consistente overespressione del geneĀ TCL1 che mappa a livello della banda 14q32.1, determinata da un meccanismo di demetilazione del promotore (Yuille MR et al, 2001) e/o da due geni a microRNA, miR-29 and miR-181 (Efanov A et al, 2010).Ā Esiste la documentazione che il topo transgenico per un costrutto che contiene lāenhancer del gene Ig ed il geneĀ TCL1 sviluppa unāespansione clonale B-CD5+, che con il passare del tempo assume le caratteristiche della LLC (Bichi R et al, 2002).Ā Analogamente, il topo transgenico che iperesprime miR-29 nei linfociti B, puĆ² sviluppare la LLC (Santanam U et al, 2010).Ā Il ruolo diĀ TCL1Ā nella patogenesi della LLC ĆØ mediato dalla riduzione dellāattivitĆ della DNA metiltansferasi 3A con conseguente diminuzione della metilazione del DNA (Palamarchuk A et al, 2012).
La famiglia dei miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) risulta frequentemente ipoespressa nella LLC. Questi geni a miRNA sono target trascrizionali diretti di p53 e sono coinvolti nel pathways dellāapoptosi p53-mediata. Ridotti livelli di miR-34, associati o meno a del17p/ mutazione TP53 o a delezione 11q (ove sono situati i geni che codificano per miR-34b e miR34c) si associano a forme di malattia piĆ¹ aggressiva (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Il profilo di espressione di numerosi altri miRNA (tra i quali miR21, miR181, miR155) riveste un ruolo prognostico nella LLC (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Studi recenti hanno dimostrato come diversi microRNA siano implicati a vario livello anche nella via di segnalazione del BCR e nelle interazioni con il microambiente (Balatti V et al, 2015), con un ruolo di regolazione della proliferazione e apoptosi delle cellule leucemiche che viene attualmente studiato come possibile target terapeutico (Bottoni A et al, 2016).
– Mutazioni geniche ricorrenti
Il sequenziamento del genoma di pazienti affetti da LLC (Puente XS et al, 2011; Fabbri G et al, 2011)
ha dimostrato che la LLC si associa a mutazioni di tipo non-silente di numerosi geni, in grado di alterare la funzione delle corrispondenti proteine. Queste mutazioni appaiono piĆ¹ frequenti delle lesioni che comportano perdita o guadagno di materiale genico e sono in genere variabili da paziente a paziente pur potendosi individuare alcuni pathways comunemente coinvolti: regolazione del ciclo cellulare e apoptosi, risposta al danno del DNA, processazione del RNA, vie di segnalazione intracellulare (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). Alcune di queste lesioni sono ricorrenti:
- Regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno del DNA: oltre alle lesioni diĀ TP53,Ā trattate nel paragrafo 17p-, e di ATM, trattate nel paragrafo 11q-, tra i geni coinvolti nella riparazione/protezione del DNA ĆØ risultato mutato in maniera ricorrente POT1, codificante una componente del sistema di mantenimento dei telomeri e mutato in circa il 3% dei pazienti con LLC, tutti appartenenti al sottogruppo con IGHV non mutato (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
- Vie di segnalazione intracellulare: le lesioni diĀ NOTCH1,Ā presenti nel 10-15% dei casi, comportano lāaccumulo di unāisoforma attiva della proteina che ĆØ in grado attivare il signalling intracellulareĀ NOTCH1-correlato.Ā I pazienti con questa mutazione presentano in genere una malattia relativamente aggressiva, associata al frequente sviluppo di farmacoresistenza e alla possibile tendenza allāevoluzione in sindrome di Richter . Le mutazioni diĀ NOTCH1Ā sono piĆ¹ frequenti nei pazienti conĀ IGHV non mutato e con la trisomia 12 (Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012).
- Oltre alla mutazione del gene stesso, multiple lesioni genetiche ricorrenti in pazienti con LLC sembrano convergere sullāattivazione della via di NOTCH1, in particolare la mutazione inattivante di FBXW7, il cui prodotto interviene nella degradazione della proteina NOTCH1, e una mutazione nella regione non codificante 3ā UTR di NOTCH1 che ne altera lo splicing (Puente XS et al, 2015; Fabbri G et al, 2016). Lāeffettiva incidenza della deregolazione della via di NOTCH1 nella LLC potrebbe quindi essere sottostimata.
- Diverse mutazioni ricorrenti nella LLC si traducono invece nellāattivazione del complesso trascrizionale NF-kB. BIRC3 codifica per una proteina che down-regola il signalling di NF-ĪŗB e presenta mutazioni inattivanti nel 20% circa delle LLC chemio-refrattarie. La frequenza di queste mutazioni ĆØ bassa (<5%) nelle fasi iniziali della malattia (Rossi D et al, 2012). Le lesioni di MYD88,Ā rinvenute nel 5% dei casi e con maggior frequenza nelle LLC con geniĀ IGHVmutati,Ā comportano la deregolazione di multipli pathways di segnalazione intracellulare con attivazione di target diversi tra cui NF-kB e STAT3 (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). In una piccola frazione di pazienti (1-3%), accomunati da un decorso aggressivo, risulta invece inattivato il gene NFKBIE che codifica un regolatore negativo diretto (IkBe) di NF-kB (Mansouri L et al, 2015).
- Processazione RNA: Nel 5% delle LLC alla diagnosi si ritrovano mutazioni del geneĀ SF3B1, che codifica per una proteina coinvolta nello splicing del RNA. Le conseguenze della mutazione di SF3B1 nella patogenesi della LLC sono state recentemente studiate con unāanalisi trascrittomica che ha dimostrato lāalterazione di meccanismi di riparazione del DNA, di mantenimento delle sequenze telomeriche e, nuovamente, del signalling di NOTCH1 (Wang L et al, 2016). Queste mutazioni sono piĆ¹ frequenti nelle LLC con 11q- (Wang L et al, 2011),Ā si associano ad uno stadio piĆ¹ avanzato, allo stato non mutato dei geniĀ IGHVĀ e alla positivitĆ per ZAP70 (Quesada V et al, 2011).Ā Anche questa lesione, al pari delle mutazioni diĀ NOTCH1Ā si rinviene piĆ¹ frequentemente nelle LLC chemiorefrattarie (Rossi D et al, 2011).
Eā interessante notare come le mutazioni diĀ TP53,Ā NOTCH1,Ā SF3B1Ā eĀ BIRC3Ā siano nella maggior parte dei casi mutualmente esclusive nei casi di LLC refrattari alla fludarabina, per cui ĆØ ragionevole ipotizzare che oltre aĀ TP53, le vie del signaling di NOTCH1 ed NF-ĪŗB e il sistema dello splicing possano giocare un ruolo indipendente nella genesi della chemiorefrattarietĆ .
Il progresso delle tecniche di sequenziamento del DNA (next generation sequencing) ne ha consentito lāapplicazione su grandi coorti di pazienti (Puente XS et al, 2015; Landau DA et al, 2015). Il sequenziamento dellāintero genoma codificante in 538 casi di LLC (Landau DA et al, 2015) ha individuato mutazioni ricorrenti a carico di due ulteriori pathways con ruolo patogenetico importante: i geni PTPN11 e FUBP1 sono modulatori dellāattivitĆ di MYC, mentre le mutazioni di NRAS, KRAS e BRAF implicano il coinvolgimento della via di segnalazione MAPK-ERK. Le lesioni ricorrenti di RPS15, coinvolto nel processo di splicing, e di IKZF3, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dei linfociti B, si sono rivelate mutazioni ādriverā precedentemente non note nella patogenesi della malattia (Landau DA et al, 2015). Un dato estremamente interessante ĆØ emerso dal sequenziamento su larga scala (506 pazienti) anche delle regioni non codificanti del genoma dei casi di LLC, con lāidentificazione di mutazioni ricorrenti in queste sequenze in grado di modificare lāespressione di geni codificanti. Le piĆ¹ rilevanti sono la mutazione ricorrente della regione 3ā UTR di NOTCH1, che ne altera il processo di splicing con delezione del dominio PEST e incremento della stabilitĆ della proteina, e la mutazione a carico di una regione enhancer del cromosoma 9p13, che si associa ad una ridotta espressione del fattore di trascrizione PAX5, essenziale nel differenziamento B-linfocitario (Puente XS et al, 2015).
–Ā Telomeri
I telomeri sono costituiti da sequenze ripetute di DNA che conferiscono stabilitĆ alla struttura dei cromosomi. Con lāinvecchiamento della cellula ed in seguito ai cicli replicativi a cui questa va incontro si assiste ad un accorciamento dei telomeri, che viene normalmente limitato dallāattivitĆ delle telomerasi.Ā Nella LLC i telomeri
dei linfociti patologici sono piĆ¹ corti rispetto ai linfociti B normali di soggetti di pari etĆ e sesso.Ā Inoltre lāaccorciamento dei telomeri ĆØ piĆ¹ spiccato nelle LLC ānon-mutateā, nelle quali si rinviene anche una maggiore attivitĆ telomerasica (Damle RN et al, 2004; Grabowski P et al, 2005) e si associa ad una prognosi sfavorevole e ad unāaumentata probabilitĆ di sviluppare la sindrome di Richter
(Rossi D et al, 2009).Ā Queste osservazioni indicano come la storia replicativa della LLC sia differente a seconda dello stato mutazionale dei geni Ig e come nei casi piĆ¹ aggressivi vi sia stato uno stimolo proliferativo nelle fasi di emergenza del clone neoplastico in grado di indurre numerosi cicli di attivazione e replicazione con accorciamento, disfunzione e fusione dei telomeri e conseguente insorgenza di esteso danno del genoma (Lin TT et al, 2010).
Un recente lavoro di sequenziamento del genoma in pazienti con LLC familiare ha dimostrato la presenza di mutazioni germline proprio a carico di geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri (in particolare POT1), sottolineando come la disregolazione di questi fini meccanismi di protezione del DNA svolga un ruolo chiave nella patogenesi della LLC (Speedy HE et al, 2016).
Anomalie citogenetiche
Lāintroduzione della FISH ha permesso lāindividuazione di aberrazioni cromosomiche in circa lā80% dei casi di LLC e ogni paziente viene oggi incluso in uno specifico gruppo in base a una classificazione citogenetica gerarchica che attribuisce importanza decrescente alle seguenti lesioni: 17p- > 11q- > +12 > 13q-. I risultanti gruppi citogenetici hanno una frequenza diversa a seconda dello stadio di malattia, come riportato in Tabella II.
Tabella II. Frequenza (% di casi) di aberrazioni cromosomiche alla FISH, di lesioni genetiche e stato mutazionale IGHV in >4000 casi di LLC arruolati nei protocolli del GCLLSG (*)
Recentemente, lāintroduzione di una stimolazione efficace delle mitosi mediante oligonucleotidi e IL2 ha mostrato che approssimativamente il 30% delle LLC senza difetti cromosomici mediante analisi FISH in interfase puĆ² presentare una lesione cromosomica nel cariotipo allāanalisi citogenetica e come questi pazienti āFISH normaliā con anomalie citogenetiche nel cariotipo abbiano una prognosi sfavorevole (Rigolin GM et al, 2012).Ā Inoltre, ĆØ stato dimostrato con questa tecnica che cariotipi complessi potevano essere documentati in una significativa frazione dei casi in associazione con fattori prognostici e quadro clinico sfavorevole (Haferlach C et al, 2007; Rigolin GM et al, 2015). Un quadro riassuntivo del significato delle principali lesioni citogenetiche ĆØ presentato in Tabella III.
Tabella III: Significato clinicobiologico dei difetti cromosomici ricorrenti nella LLC
Nuove sottili aberrazioni sono state identificate mediante sensibilissime tecniche di scansione dellāintero genoma, grazie alla quale sono state documentate lesioni genetiche in virtualmente tutti i casi di LLC (Grubor V et al, 2009).
13q-
A cura di: Danilo G. Faraci, Antonio Cuneo, Ematologia, UniversitĆ di Ferrara
La delezione 13q14 ĆØ la piĆ¹ frequente anomalia citogenetica nella LLC e viene identificata alla FISH in piĆ¹ del 50% dei casi. Questa delezione ĆØ stata descritta come eterozigote in approssimativamente il 75-80% dei casi e omozigote nel restante 20-25%. Studi molecolari hanno dimostrato che la regione comunemente deleta comprende 790 kb tra i marcatori D13S1150 e D13S25.
Pekarsky et al (Pekarsky Y e Croce CM, 2015) hanno individuato tra i geni target della delezione 13q14, un cluster di 30 kb tra gli esoni 2 e 5 del gene DLEU2 codificante per due microRNA (miR-15a/miR-16-1) in grado di regolare la funzione di molteplici oncogeni, principale dei quali risulta essere BCL-2. Tale proteina, nella maggioranza dei casi di LLC, risulta overespressa, facendo intendere pertanto la funzione oncosoppressoria di miR-15a e miR-16-1. La delezione di questi geni per microRNA ĆØ stata recentemente confermata da altri ricercatori che hanno utilizzato CGH array ad alta risoluzione in 58 casi di LLC (Buhl AM et al, 2006).
Nel 2010, Klein et al (Klein U et al, 2010) hanno evidenziato che, se nel topo transgenico la delezione ĆØ ampia, coinvolgendo sia il cluster miR-15/16-1 che altri loci mappati su DLEU2, anche la malattia assume un decorso piĆ¹ grave, con una proliferazione linfoide piĆ¹ marcata ed aggressiva.
La categoria di pazienti che non presentano altre anomalie cromosomiche associate alla delezione 13q14 ĆØ quella a prognosi piĆ¹ favorevole con intervallo tra diagnosi e inizio del trattamento e sopravvivenza superiori rispetto alla LLC con cariotipo normale.
Tuttavia alcune differenze in termini di predittivitĆ del decorso clinico sono state osservate in rapporto a, i) delezione eterozigorte o omozigote, ii) grandezza del clone con delezione, iii) ampiezza delle delezione.
Garg R et al, 2012 hanno dimostrato che i pazienti con delezione eterozigote e quelli con delezione omozigote presentano un andamento clinico sovrapponibile. Tale evidenza smentirebbe precedenti ipotesi secondo le quale i pazienti omozigoti potrebbero presentare una maggiore cinetica di crescita linfocitaria rispetto agli eterozigoti.
Individui con unāalta percentuale di cellule con nuclei deleti sembrano avere un decorso piĆ¹ aggressivo della malattia, rientrando a tutti gli effetti nella categoria di rischio citogenetico intermedio (Van Dyke DL et al, 2010).
Dal Bo et al (Dal Bo M et al, 2011) hanno stabilito come cut-off il 70% di nuclei del clone con delezione 13q14, e hanno diviso i casi di LLC del loro studio in quattro sottogruppi: pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1, pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, e pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1. Di questi, solo il primo gruppo manteneva una prognosi favorevole, mentre gli altri tre presentavano un decorso clinico simile alla LLC con cariotipo normale, con diminuzione di TFT e OS. La delezione di oltre il 70% di nuclei delle cellule del clone appare quindi come un marker indipendente di progressione, con impatto maggiore rispetto allāampiezza della delezione stessa. Tale dato veniva confermato da Van Dyke et al (Van Dyke DL et al, 2016), (dimostrando che i pazienti aventi >85% nuclei 13q- presentano unāevoluzione clinica peggiore, con TFT sovrapponibile a quelli aventi cariotipo normale o trisomia 12.
La minima regione deleta (MDR) del 13q include i loci DLEU2/MIR15A/MIR161, mentre nei casi con ampia delezione il segmento perso puĆ² comprendere anche il gene RB1 (banda 13q14.1-q14.2). Xiong et al (Xiong W et al, 2015) hanno dimostrato, mediante lāutilizzo di sonde specifiche per MDR e RB1 alla FISH, che i pazienti aventi unāampia delezione presentano TFT e OS nettamente piĆ¹ brevi rispetto ai pazienti aventi minima delezione. Tale dato veniva invece contraddetto dai ricercatori canadesi della British Columbia, i quali hanno evidenziato almeno 9 possibili combinazioni di delezione 13q14 a seconda dei geni deleti e della presenza dellāalterazione in entrambi gli alleli o meno. PiĆ¹ comunemente lāampia delezione risulta monoallelica (55%), fattore che potrebbe spiegare lāimpatto non significativo del coinvolgimento del gene RB1 nellāoutcome dei pazienti (Huang SJ et al, 2016). Pure Haferlach et al (Haferlach C et al, 2012) hanno dimostrato che lāampia delezione non influisce negativamente sul TFT. Data la discrepanza dei risultati ottenuti finora dai diversi studi, pertanto il significato prognostico dellāampiezza della delezione 13q14 risulta poco chiaro e rimane ad oggi unāinteressante questione scientifica.
In conclusione, il gruppo di pazienti con 13q- isolata parrebbe essere non omogeneo, in quanto recenti studi hanno messo in evidenza che la percentuale di cellule del clone che presentano nuclei deleti sia in grado di influenzare il decorso e la prognosi della malattia, con la conseguente necessitĆ di ridefinirne il rischio in base a tale parametro. Per quanto riguarda lāampiezza della delezione stessa, ulteriori studi sono necessari. Risulta evidente che lāimplicazione clinica della delezione 13q14 assume quindi un significato piĆ¹ complesso di quanto originariamente attribuitogli.
INTRODUZIONE
Rispetto alla visione storica che definiva la leucemia linfatica cronica (LLC) una malattia indolente da accumulo di piccoli linfociti, le conoscenze patogenetiche hanno consentito di riconoscere questa condizione come una malattia dinamica, che trae la sua origine da una ricca serie di eventi biologici e genetici primari e secondari. Lāinterazione con gli antigeni, lo stato di āattivazioneā cellulare che ne segue e le complesse interazioni con il microambiente plasmano una malattia dal decorso eterogeneo, talora preceduta da una condizione predisponente, la linfocitosi B-monoclonale (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL) recentemente definita nei suoi contorni nosografici. Grazie ai progressi sulla comprensione dei meccanismi che governano la storia naturale della LLC lāapproccio moderno alla gestione del paziente si avvale di una caratterizzazione clinica che prevede lo studio di una serie di marcatori prognostici, molto utili per lāadeguata programmazione di terapie sempre piĆ¹ efficaci, che includono oggi alcune molecole in grado di interferire con processi essenziali per la sopravvivenza e la crescita del linfocito neoplastico.
Definizione e cenni epidemiologici
La LLC ĆØ un disordine linfoproliferativo cronico che coinvolge i linfociti B CD5-positivi e che rientra tra le neoplasie a cellule B-mature della classificazione WHO (Muller-Hermelink HK et al, 2008). Eā piĆ¹ frequente nei maschi che nelle femmine (1,5-2,0/1), ed ha unāincidenza nei paesi occidentali, riferita a 100.000 abitanti, compresa tra 2-6 casi/anno, mentre ĆØ rara in Giappone e nei paesi orientali, ove lāincidenza ĆØ <1 caso/100.000 abitanti (Redaelli A et al, 2004) (Figura Ia).
LāetĆ media alla diagnosi ĆØ attorno ai 70 anni, e lāincidenza aumenta da 1 caso/anno/100.000 abitanti nella fascia 40-50 anni a 20 casi nella fascia 70-80 anni. Oltre il 40% delle LLC ĆØ diagnosticata ad unāetĆ >75 anni, mentre meno del 10% ĆØ diagnosticata prima dei 50 anni (Brenner H et al, 2008) (Figura Ib).
Figura I. a) incidenza nei diversi paesi; b) incidenza per etĆ
Eziologia
Lāeziologia della LLC non ĆØ nota. Non puĆ² essere escluso un ruolo per le radiazioni ionizzanti (Richardson DB et al, 2005), anche se lo studio della popolazione sopravvissuta allāincidente nucleare di Chernobyl ha mostrato un aumento di incidenza di molte forme di leucemia, ma non di LLC (Lin SL et al, 2009). Alcune attivitĆ agricole, con particolare riguardo allāimpiego di pesticidi si possono associare ad un aumento dei casi di LLC (Caporaso N et al, 2004).
Vi ĆØ evidenza di una possibile associazione tra LLC e fattori genetici. La LLC ha unāincidenza bassa nelle popolazioni orientali rispetto agli occidentali e i gruppi etnici che migrano in altri paesi mantengono lāincidenza di questa malattia al livello di quella del paese di provenienza.Ā Nei parenti di primo grado di soggetti affetti da LLC il rischio di sviluppo della malattia e di altre sindromi linfoproliferative (linfoma di Hodgkin e non Hodgkin) ĆØ superiore rispetto a quello della popolazione generale di pari etĆ e sesso (Capalbo S et al, 2000; Goldin LR et al, 2004) e si possono rinvenire espansioni di piccoli cloni B linfocitari con fenotipo classico della LLC e negativitĆ per CD38, con una frequenza francamente maggiore rispetto alla popolazione generale (Rawstron AC et al, 2002). In unāanalisi di 24 famiglie con piĆ¹ di due membri affetti si ĆØ potuto documentare, accanto alle classiche anomalie citogenetiche, una elevata frequenza di delezioni o guadagno di materiale genetico a livello delle bande Xp11.1-p21, Xq21-qter, 2p12-14 e 4q11-21 (Martin AJ et al, 2002).Ā Eā possibile che, diversamente dal cancro mammario, ove un gene (BRCA1) ha un importantissimo effetto, il substrato genetico della LLC consista nellāintervento di piĆ¹ geni con basso potenziale predisponente (Goldin LR et al, 2007).
Patogenesi
A cura di: Sara Martinelli (Struttura semplice di Ematologia- UnitĆ operativa di Medicina Interna – Ospedale S. Chiara di Trento).
La patogenesi della LLC riconosce numerosi momenti (Tabella I), incentrati sulle particolaritĆ della cellula dāorigine, sulle sue interazioni con ipotetici antigeni e con il microambiente e sullo sviluppo di una vasta gamma di lesioni genetiche.
Tabella I: Momenti patogenetici nella LLC
a) Cellula dāorigine
Per molto tempo lāespressione del CD5 da parte delle cellule della LLC ha fatto ritenere che la controparte cellulare normale fosse rappresentata dal subset di linfociti B-1 (definito nel topo, senza un chiaro corrispettivo nellāuomo), coinvolto nellāimmunitĆ innata e in grado di produrre anticorpi naturali mediante una reazione T-indipendente (Darzentas N et al, 2010). Nellāuomo, lāespressione di CD5 caratterizza le cellule B vergini, mentre viene persa dopo lāincontro con lāantigene. In una parte dei casi di LLC (50-80% nelle varie casistiche) la cellula leucemica presenta >2% di mutazioni somatiche nella sequenza del gene codificante per la porzione variabile delle catene pesanti delle Ig (IGHV), un processo (ipermutazione somatica) che fisiologicamente avviene allāinterno del centro germinativo, grazie allāintervento di enzimi quali lāactivation-induced cytidine deaminase (AID), in risposta ad antigeni T-dipendenti. La restante parte delle LLC presenta una configurazione āgermlineā della porzione variabile del gene Ig (i.e. <2% di mutazioni). Il passaggio attraverso il centro germinativo, che quindi caratterizza le LLC āmutateā, ĆØ tuttavia incompatibile con la derivazione dai linfociti B-1. Inoltre, lo studio del profilo di espressione genica ha mostrato ampia omogeneitĆ tra i diversi casi di LLC, indipendentemente dallo stato mutazionale dei geni IGHV, ed ĆØ risultato somigliante a quello delle cellule B memoria CD27+. I casi di LLC āmutateā potrebbero quindi rappresentare lāespansione di cellule B memoria CD27+ che, in seguito allāincontro con un antigene T-dipendente, hanno attraversato le fasi del centro germinativo; i casi di LLC ānon mutateā potrebbero invece derivare da una frazione minoritaria di cellule B CD27+ che hanno incontrato lāantigene in maniera T-indipendente ed hanno sviluppato un fenotipo āmemoriaā senza passaggio attraverso il centro germinativo (Klein U et al, 2001; Rosenwald A et al, 2001). Lāespressione del CD5 potrebbe essere coerente con lāorigine delle LLC āmutateā da un subset recentemente riconosciuto di cellule B memoria CD27+ CD5+, mentre per le LLC ānon mutateā lāespressione del CD5 sarebbe suggestiva di una origine da cellule B vergini pre-centro germinativo, ipotesi sostenuta anche da alcuni studi di espressione genica (Seifert M et al, 2012), non potendo tuttavia escludere che il fenotipo di superficie possa essere stato alterato dal processo stesso di trasformazione o da uno stato di anomala attivazione e che quindi il CD5 sia comunque espresso da cellule che hanno effettivamente incontrato lāantigene (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
Accanto alle controversie relative allāorigine della cellula B matura la cui espansione determina la malattia, recenti evidenze suggeriscono che le piĆ¹ precoci alterazioni genetiche ed epigenetiche che predispongono allo sviluppo della LLC si verifichino a monte, a livello della cellula staminale emopoietica pluripotente (HSCs). Per effetto di queste lesioni precoci, la cui natura non ĆØ al momento chiara, il destino di questi progenitori viene orientato verso il lineage B linfocitario, con successiva selezione, per effetto della stimolazione antigenica, di elementi maturi della loro progenie che vanno incontro ad unāespansione prima oligoclonale, quindi monoclonale per accumulo di ulteriori lesioni genetiche (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
b) Ruolo della stimolazione antigenica
Eā noto che il clone trasformato nella LLC presenta un utilizzo preferenziale di alcune famiglie V, D e J (ad esempio VH1-69; VH4-34), che non riflette la frequenza di questi riarrangiamenti nella popolazione B-linfocitaria CD5 normale. PoichĆ© queste sequenze, assemblate durante la maturazione B-linfocitaria intramidollare, formano la porzione variabile del gene Ig espressa in superficie come BCR, si puĆ² dedurre che alcuni antigeni sono in grado di ingaggiare i cloni esprimenti questi BCR favorendone lāespansione e la successiva trasformazione. Questo concetto ĆØ stato rafforzato dalla dimostrazione di āBCR stereotipatiā, che presentano una identica sequenza che codifica per la porzione del BCR che lega lāantigene nota come ācomplementarity determining regionā (CDR) (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008; Ghiotto F et al, 2004; Tobin G et al, 2004) .Ā Vista la complessitĆ degli eventi di ricombinazione che portano allāassemblaggio del BCR, la probabilitĆ che due linfociti B normali possano avere casualmente un BCR stereotipato ĆØ dellāordine di 10-12, mentre ĆØ stato osservato che fino al 30 % dei casi di LLC puĆ² mostrare questo fenomeno (Stamatopoulos K et al, 2007). Tra gli antigeni in grado di ingaggiare il BCR nella LLC si annoverano gli elementi polisaccaridici batterici, il fattore reumatoide, il DNA, la cardiolipina, antigeni espressi sulle cellule apoptotiche (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008). Si ĆØ cosƬ affermato in questi ultimi anni il concetto di una relazione patogenetica tra stimolazione antigenica, spesso sostenuta da autoantigeni, e LLC17. In effetti ĆØ stata fornita una recente elegante dimostrazione di come una proteina, nota come ācatena pesante della miosina non-muscolareā (non muscle myosin heavy chain), avente un ruolo nel movimento cellulare, possa essere esposta sulla superficie delle cellule apoptotiche e di come la maggior parte della LLC ānon-mutateā possa riconoscere tramite i suoi anticorpi questo antigene (Chu CC et al, 2010).
Esiste inoltre dimostrazione che il linfocito della LLC puĆ² mantenere la capacitĆ di rispondere allāantigene a) andando incontro in vivo a switch di classe Ig (Malisan F et al, 1996) b) sviluppando nuove mutazioni del gene IGHV (Gurrieri C et al, 2002), c) esprimendo lāenzima AID (Oppezzo P et al, 2003), importante nel processo di ipermutazione somatica; d) modificando il profilo di espressione genica e attivando il ciclo cellulare (Guarini A et al, 2008).Ā Eā interessante notare che queste caratteristiche sono piĆ¹ spiccate nei casi di LLC ānon-mutateā CD38+ e ZAP-70+, rispetto alle altre LLC (Lanham S et al, 2003; Chen L et al, 2002).Ā In effetti, nelle LLC ānon-mutateā, il BCR-signaling ĆØ attivo, mentre nelle forme āmutateā ĆØ inattivo in seguito ad uno stato di anergia funzionale legato ad una protratta stimolazione antigenica, con conseguente desensibilizzazione del BCR stesso (Stevenson FK et al, 2004).Ā Questa condizione di āanergiaā si associa ad uno specifico profilo di espressione di geni coinvolti nel signaling BCR-mediato (Muzio M et al, 2008).
Il BCR signaling derivante dalla stimolazione antigenica comporta il coinvolgimento di una serie di molecole che regolano la vita del linfocito neoplastico (Burger JA, 2011). Alcune di queste molecole quali la Bruton tirosin chinasi (BTK) e la subunitĆ delta della fosfatidil-inositol-3 chinasi (PI3K delta), rappresentano bersagli per terapie mirate di dimostrata efficacia (FoĆ R et al, 2013).
Recentemente ĆØ stata inoltre dimostrata la capacitĆ , esclusiva dei BCRs dei linfociti neoplastici in corso di LLC, di attivare la cascata di segnalazione intracellulare indipendentemente da una stimolazione antigenica (DĆ¼hren-von Minden M et al, 2012). Questa proprietĆ sembra essere strettamente dipendente dallāinterazione delle regioni HCDR3 dei BCRs dei linfociti leucemici con specifici epitopi intrinseci degli stessi BCRs. Presumibilmente solo alcune sequenze HCDR3 e alcuni specifici epitopi intrinseci hanno questa peculiaritĆ , il che potrebbe giustificare la selezione di un ristretto repertorio di BCRs ed il fenomeno dei recettori stereotipati. Pur non escludendo il probabile contributo di una selezione antigenica specifica, questa ipotesi fornisce una spiegazione alternativa, antigene-indipendente, del fenomeno, ed individua un potenziale nuovo target terapeutico nellāinibizione del signalling autonomo del BCR in pazienti con LLC (DĆ¼hren-von Minden M et al, 2012).
c) Turn-over cellulare
Ā Contrariamente a quanto ritenuto nel recente passato, la LLC non puĆ² essere oggi considerata una patologia da accumulo di linfociti che non vanno incontro ad apoptosi. I linfociti patologici mantengono la sensibilitĆ ad alcuni stimoli pro-apoptotici mediati da Fas e dal legame di anticorpi anti IgM che ingaggiano il BCR (Chu P et al, 2002; Zupo S et al, 2002) e proliferano in vivo ad un ritmo pari allo 0,1-1% dellāintero clone ogni giorno (Messmer BT et al, 2005). Il ritmo di divisione cellulare e di rinnovo ĆØ piĆ¹ elevato nella frazione cellulare CD38+ (Calissano C et al, 2009).
d) Interazioni con il microambiente
Nei linfonodi dei soggetti con LLC esiste un comparto di āaccumuloā costituito da piccoli linfociti ed un comparto, quello dei ācentri di proliferazioneā, ricco in paraimmunoblasti e prolinfociti, ove le cellule mostrano i caratteri dellāattivazione e vanno incontro a divisione cellulare. Queste strutture istologiche, che conferiscono un quadro pseudofollicolare al linfonodo della LLC, si rinvengono anche nei tessuti infiammati dei soggetti affetti da patologia autoimmune (Humby F et al, 2009) e richiamano il concetto del ruolo della stimolazione da parte di autoantigeni nella genesi della LLC. Nei centri di proliferazione i prolinfociti e i paraimmunoblasti sono a stretto contatto con linfociti T CD4 e cellule follicolari dendritiche. Nel comparto di āaccumuloā i piccoli linfociti interagiscono con cellule stromali mesenchimali e con cellule ānutriciā (ānurselike cellsā) differenziatesi da monociti circolanti, in un contesto di interazioni cellula-cellula che ne favorisce la sopravvivenza.Ā In effetti, la stimolazione da parte del CD40 ha un ruolo nel mantenimento in vita del clone B-linfocitario, al pari dellāinterazione con i linfociti T CD4, in grado di determinare la produzione di citochine anti-apoptotiche (IL4, IFN) (Ghia P, Caligaris-Cappio F, 2000). Lāimportanza in vivo della presenza dei linfociti T CD4 ĆØ stata recentemente dimostrata in un modello murino immunodeficiente, in cui il trasferimento di cellule LLC dava origine alla malattia solo in presenza di linfociti T CD4 autologhi (Bagnara D et al, 2011). Le cellule T sono reclutate nel microambiente tumorale da chemochine prodotte dalle cellule leucemiche e ne favoriscono la sopravvivenza tramite interazioni cellulari, in particolare il legame CD40-CD40L. Le cellule leucemiche esprimono inoltre recettori inibitori e producono molecole solubili in grado di rendere inefficace lāattivitĆ delle cellule T CD4, CD8 ed NK e sfuggire cosƬ alla sorveglianza immunitaria (ten Hacken E, Burger JA, 2014)
Nella distribuzione e sopravvivenza delle cellule patologiche (Stevenson FK, Caligaris-Cappio F, 2004) giocano un ruolo importante a) alcune chemochine e loro recettori, espressi dal linfocito leucemico (CXCR3 e CXCR5), b) cellule del sangue periferico in grado di differenziarsi in cellule ānutriciā (ānurselikeā), che favoriscono la sopravvivenza e la migrazione del linfocito allāinterno degli spazi midollari attraverso lo stromal-derived growth factor (Burger JA et al,1999), c) le cellule dendritiche, attraverso il CD44 e grazie allāinduzione dellāespressione di una proteina BCL2 correlata (Mcl-1) (Pedersen IM et al, 2002).Ā Lāangiogenesi puĆ² giocare un ruolo nelle fasi di accelerazione della malattia o nei sottogruppi piĆ¹ aggressivi, ove si riscontrano livelli serici piĆ¹ elevati di VEGF (Molica S et al, 2002; Maffei R et al, 2010).
e) Lesioni citogenetico-molecolari
– geni microRNA e TCL1
Nella LLC non ĆØ ad oggi nota la lesione genetica primaria in grado di innescare il processo di trasformazione, ma sono disponibili numerose informazioni su una serie di lesioni che governano il processo di trasformazione (Figura II).
Figura II. Stimolazione antigenica e lesioni citogenetico-molecolari nella patogenesi della LLC
Sono stati localizzati due geni codificanti per microRNA (i.e miR-15 e miR-16) nella regione 13q14, deleta in un 40-50% delle LLC. Questi geni mostrano ridotta espressione in seguito a delezione nella LLC (Calin GA et al, 2002) e, in queste condizioni, puĆ² risultare alterata lāespressione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei linfociti B, in particolare il gene antiapoptotico BCL-2. In effetti, la delezione di miR-15 e miR-16 nel topo determina lāinsorgenza di unāespansione clonale di linfociti B che presenta le caratteristiche biologiche della LLC. La proliferazione linfoide ĆØ piĆ¹ marcata e aggressiva se la delezione coinvolge, oltre ai suddetti geni a microRNA, il gene DLEU2 che mappa nella stessa regione (Klein U et al, 2010).Ā La concomitante delezione di DLEU7, posizionato allāinterno della regione di minima delezione, puĆ² contribuire alla patogenesi per la perdita/riduzione della sua fisiologica funzione di inibizione di NF-kB (Palamarchuk A et al, 2010).
Nella LLC, inoltre, vi ĆØ una consistente overespressione del geneĀ TCL1 che mappa a livello della banda 14q32.1, determinata da un meccanismo di demetilazione del promotore (Yuille MR et al, 2001) e/o da due geni a microRNA, miR-29 and miR-181 (Efanov A et al, 2010).Ā Esiste la documentazione che il topo transgenico per un costrutto che contiene lāenhancer del gene Ig ed il geneĀ TCL1 sviluppa unāespansione clonale B-CD5+, che con il passare del tempo assume le caratteristiche della LLC (Bichi R et al, 2002).Ā Analogamente, il topo transgenico che iperesprime miR-29 nei linfociti B, puĆ² sviluppare la LLC (Santanam U et al, 2010).Ā Il ruolo diĀ TCL1Ā nella patogenesi della LLC ĆØ mediato dalla riduzione dellāattivitĆ della DNA metiltansferasi 3A con conseguente diminuzione della metilazione del DNA (Palamarchuk A et al, 2012).
La famiglia dei miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) risulta frequentemente ipoespressa nella LLC. Questi geni a miRNA sono target trascrizionali diretti di p53 e sono coinvolti nel pathways dellāapoptosi p53-mediata. Ridotti livelli di miR-34, associati o meno a del17p/ mutazione TP53 o a delezione 11q (ove sono situati i geni che codificano per miR-34b e miR34c) si associano a forme di malattia piĆ¹ aggressiva (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Il profilo di espressione di numerosi altri miRNA (tra i quali miR21, miR181, miR155) riveste un ruolo prognostico nella LLC (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Studi recenti hanno dimostrato come diversi microRNA siano implicati a vario livello anche nella via di segnalazione del BCR e nelle interazioni con il microambiente (Balatti V et al, 2015), con un ruolo di regolazione della proliferazione e apoptosi delle cellule leucemiche che viene attualmente studiato come possibile target terapeutico (Bottoni A et al, 2016).
– Mutazioni geniche ricorrenti
Il sequenziamento del genoma di pazienti affetti da LLC (Puente XS et al, 2011; Fabbri G et al, 2011)
ha dimostrato che la LLC si associa a mutazioni di tipo non-silente di numerosi geni, in grado di alterare la funzione delle corrispondenti proteine. Queste mutazioni appaiono piĆ¹ frequenti delle lesioni che comportano perdita o guadagno di materiale genico e sono in genere variabili da paziente a paziente pur potendosi individuare alcuni pathways comunemente coinvolti: regolazione del ciclo cellulare e apoptosi, risposta al danno del DNA, processazione del RNA, vie di segnalazione intracellulare (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). Alcune di queste lesioni sono ricorrenti:
- Regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno del DNA: oltre alle lesioni diĀ TP53,Ā trattate nel paragrafo 17p-, e di ATM, trattate nel paragrafo 11q-, tra i geni coinvolti nella riparazione/protezione del DNA ĆØ risultato mutato in maniera ricorrente POT1, codificante una componente del sistema di mantenimento dei telomeri e mutato in circa il 3% dei pazienti con LLC, tutti appartenenti al sottogruppo con IGHV non mutato (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
- Vie di segnalazione intracellulare: le lesioni diĀ NOTCH1,Ā presenti nel 10-15% dei casi, comportano lāaccumulo di unāisoforma attiva della proteina che ĆØ in grado attivare il signalling intracellulareĀ NOTCH1-correlato.Ā I pazienti con questa mutazione presentano in genere una malattia relativamente aggressiva, associata al frequente sviluppo di farmacoresistenza e alla possibile tendenza allāevoluzione in sindrome di Richter . Le mutazioni diĀ NOTCH1Ā sono piĆ¹ frequenti nei pazienti conĀ IGHV non mutato e con la trisomia 12 (Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012).
- Oltre alla mutazione del gene stesso, multiple lesioni genetiche ricorrenti in pazienti con LLC sembrano convergere sullāattivazione della via di NOTCH1, in particolare la mutazione inattivante di FBXW7, il cui prodotto interviene nella degradazione della proteina NOTCH1, e una mutazione nella regione non codificante 3ā UTR di NOTCH1 che ne altera lo splicing (Puente XS et al, 2015; Fabbri G et al, 2016). Lāeffettiva incidenza della deregolazione della via di NOTCH1 nella LLC potrebbe quindi essere sottostimata.
- Diverse mutazioni ricorrenti nella LLC si traducono invece nellāattivazione del complesso trascrizionale NF-kB. BIRC3 codifica per una proteina che down-regola il signalling di NF-ĪŗB e presenta mutazioni inattivanti nel 20% circa delle LLC chemio-refrattarie. La frequenza di queste mutazioni ĆØ bassa (<5%) nelle fasi iniziali della malattia (Rossi D et al, 2012). Le lesioni di MYD88,Ā rinvenute nel 5% dei casi e con maggior frequenza nelle LLC con geniĀ IGHVmutati,Ā comportano la deregolazione di multipli pathways di segnalazione intracellulare con attivazione di target diversi tra cui NF-kB e STAT3 (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). In una piccola frazione di pazienti (1-3%), accomunati da un decorso aggressivo, risulta invece inattivato il gene NFKBIE che codifica un regolatore negativo diretto (IkBe) di NF-kB (Mansouri L et al, 2015).
- Processazione RNA: Nel 5% delle LLC alla diagnosi si ritrovano mutazioni del geneĀ SF3B1, che codifica per una proteina coinvolta nello splicing del RNA. Le conseguenze della mutazione di SF3B1 nella patogenesi della LLC sono state recentemente studiate con unāanalisi trascrittomica che ha dimostrato lāalterazione di meccanismi di riparazione del DNA, di mantenimento delle sequenze telomeriche e, nuovamente, del signalling di NOTCH1 (Wang L et al, 2016). Queste mutazioni sono piĆ¹ frequenti nelle LLC con 11q- (Wang L et al, 2011),Ā si associano ad uno stadio piĆ¹ avanzato, allo stato non mutato dei geniĀ IGHVĀ e alla positivitĆ per ZAP70 (Quesada V et al, 2011).Ā Anche questa lesione, al pari delle mutazioni diĀ NOTCH1Ā si rinviene piĆ¹ frequentemente nelle LLC chemiorefrattarie (Rossi D et al, 2011).
Eā interessante notare come le mutazioni diĀ TP53,Ā NOTCH1,Ā SF3B1Ā eĀ BIRC3Ā siano nella maggior parte dei casi mutualmente esclusive nei casi di LLC refrattari alla fludarabina, per cui ĆØ ragionevole ipotizzare che oltre aĀ TP53, le vie del signaling di NOTCH1 ed NF-ĪŗB e il sistema dello splicing possano giocare un ruolo indipendente nella genesi della chemiorefrattarietĆ .
Il progresso delle tecniche di sequenziamento del DNA (next generation sequencing) ne ha consentito lāapplicazione su grandi coorti di pazienti (Puente XS et al, 2015; Landau DA et al, 2015). Il sequenziamento dellāintero genoma codificante in 538 casi di LLC (Landau DA et al, 2015) ha individuato mutazioni ricorrenti a carico di due ulteriori pathways con ruolo patogenetico importante: i geni PTPN11 e FUBP1 sono modulatori dellāattivitĆ di MYC, mentre le mutazioni di NRAS, KRAS e BRAF implicano il coinvolgimento della via di segnalazione MAPK-ERK. Le lesioni ricorrenti di RPS15, coinvolto nel processo di splicing, e di IKZF3, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dei linfociti B, si sono rivelate mutazioni ādriverā precedentemente non note nella patogenesi della malattia (Landau DA et al, 2015). Un dato estremamente interessante ĆØ emerso dal sequenziamento su larga scala (506 pazienti) anche delle regioni non codificanti del genoma dei casi di LLC, con lāidentificazione di mutazioni ricorrenti in queste sequenze in grado di modificare lāespressione di geni codificanti. Le piĆ¹ rilevanti sono la mutazione ricorrente della regione 3ā UTR di NOTCH1, che ne altera il processo di splicing con delezione del dominio PEST e incremento della stabilitĆ della proteina, e la mutazione a carico di una regione enhancer del cromosoma 9p13, che si associa ad una ridotta espressione del fattore di trascrizione PAX5, essenziale nel differenziamento B-linfocitario (Puente XS et al, 2015).
–Ā Telomeri
I telomeri sono costituiti da sequenze ripetute di DNA che conferiscono stabilitĆ alla struttura dei cromosomi. Con lāinvecchiamento della cellula ed in seguito ai cicli replicativi a cui questa va incontro si assiste ad un accorciamento dei telomeri, che viene normalmente limitato dallāattivitĆ delle telomerasi.Ā Nella LLC i telomeri
dei linfociti patologici sono piĆ¹ corti rispetto ai linfociti B normali di soggetti di pari etĆ e sesso.Ā Inoltre lāaccorciamento dei telomeri ĆØ piĆ¹ spiccato nelle LLC ānon-mutateā, nelle quali si rinviene anche una maggiore attivitĆ telomerasica (Damle RN et al, 2004; Grabowski P et al, 2005) e si associa ad una prognosi sfavorevole e ad unāaumentata probabilitĆ di sviluppare la sindrome di Richter
(Rossi D et al, 2009).Ā Queste osservazioni indicano come la storia replicativa della LLC sia differente a seconda dello stato mutazionale dei geni Ig e come nei casi piĆ¹ aggressivi vi sia stato uno stimolo proliferativo nelle fasi di emergenza del clone neoplastico in grado di indurre numerosi cicli di attivazione e replicazione con accorciamento, disfunzione e fusione dei telomeri e conseguente insorgenza di esteso danno del genoma (Lin TT et al, 2010).
Un recente lavoro di sequenziamento del genoma in pazienti con LLC familiare ha dimostrato la presenza di mutazioni germline proprio a carico di geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri (in particolare POT1), sottolineando come la disregolazione di questi fini meccanismi di protezione del DNA svolga un ruolo chiave nella patogenesi della LLC (Speedy HE et al, 2016).
Anomalie citogenetiche
Lāintroduzione della FISH ha permesso lāindividuazione di aberrazioni cromosomiche in circa lā80% dei casi di LLC e ogni paziente viene oggi incluso in uno specifico gruppo in base a una classificazione citogenetica gerarchica che attribuisce importanza decrescente alle seguenti lesioni: 17p- > 11q- > +12 > 13q-. I risultanti gruppi citogenetici hanno una frequenza diversa a seconda dello stadio di malattia, come riportato in Tabella II.
Tabella II. Frequenza (% di casi) di aberrazioni cromosomiche alla FISH, di lesioni genetiche e stato mutazionale IGHV in >4000 casi di LLC arruolati nei protocolli del GCLLSG (*)
Recentemente, lāintroduzione di una stimolazione efficace delle mitosi mediante oligonucleotidi e IL2 ha mostrato che approssimativamente il 30% delle LLC senza difetti cromosomici mediante analisi FISH in interfase puĆ² presentare una lesione cromosomica nel cariotipo allāanalisi citogenetica e come questi pazienti āFISH normaliā con anomalie citogenetiche nel cariotipo abbiano una prognosi sfavorevole (Rigolin GM et al, 2012).Ā Inoltre, ĆØ stato dimostrato con questa tecnica che cariotipi complessi potevano essere documentati in una significativa frazione dei casi in associazione con fattori prognostici e quadro clinico sfavorevole (Haferlach C et al, 2007; Rigolin GM et al, 2015). Un quadro riassuntivo del significato delle principali lesioni citogenetiche ĆØ presentato in Tabella III.
Tabella III: Significato clinicobiologico dei difetti cromosomici ricorrenti nella LLC
Nuove sottili aberrazioni sono state identificate mediante sensibilissime tecniche di scansione dellāintero genoma, grazie alla quale sono state documentate lesioni genetiche in virtualmente tutti i casi di LLC (Grubor V et al, 2009).
13q-
A cura di: Danilo G. Faraci, Antonio Cuneo, Ematologia, UniversitĆ di Ferrara
La delezione 13q14 ĆØ la piĆ¹ frequente anomalia citogenetica nella LLC e viene identificata alla FISH in piĆ¹ del 50% dei casi. Questa delezione ĆØ stata descritta come eterozigote in approssimativamente il 75-80% dei casi e omozigote nel restante 20-25%. Studi molecolari hanno dimostrato che la regione comunemente deleta comprende 790 kb tra i marcatori D13S1150 e D13S25.
Pekarsky et al (Pekarsky Y e Croce CM, 2015) hanno individuato tra i geni target della delezione 13q14, un cluster di 30 kb tra gli esoni 2 e 5 del gene DLEU2 codificante per due microRNA (miR-15a/miR-16-1) in grado di regolare la funzione di molteplici oncogeni, principale dei quali risulta essere BCL-2. Tale proteina, nella maggioranza dei casi di LLC, risulta overespressa, facendo intendere pertanto la funzione oncosoppressoria di miR-15a e miR-16-1. La delezione di questi geni per microRNA ĆØ stata recentemente confermata da altri ricercatori che hanno utilizzato CGH array ad alta risoluzione in 58 casi di LLC (Buhl AM et al, 2006).
Nel 2010, Klein et al (Klein U et al, 2010) hanno evidenziato che, se nel topo transgenico la delezione ĆØ ampia, coinvolgendo sia il cluster miR-15/16-1 che altri loci mappati su DLEU2, anche la malattia assume un decorso piĆ¹ grave, con una proliferazione linfoide piĆ¹ marcata ed aggressiva.
La categoria di pazienti che non presentano altre anomalie cromosomiche associate alla delezione 13q14 ĆØ quella a prognosi piĆ¹ favorevole con intervallo tra diagnosi e inizio del trattamento e sopravvivenza superiori rispetto alla LLC con cariotipo normale.
Tuttavia alcune differenze in termini di predittivitĆ del decorso clinico sono state osservate in rapporto a, i) delezione eterozigorte o omozigote, ii) grandezza del clone con delezione, iii) ampiezza delle delezione.
Garg R et al, 2012 hanno dimostrato che i pazienti con delezione eterozigote e quelli con delezione omozigote presentano un andamento clinico sovrapponibile. Tale evidenza smentirebbe precedenti ipotesi secondo le quale i pazienti omozigoti potrebbero presentare una maggiore cinetica di crescita linfocitaria rispetto agli eterozigoti.
Individui con unāalta percentuale di cellule con nuclei deleti sembrano avere un decorso piĆ¹ aggressivo della malattia, rientrando a tutti gli effetti nella categoria di rischio citogenetico intermedio (Van Dyke DL et al, 2010).
Dal Bo et al (Dal Bo M et al, 2011) hanno stabilito come cut-off il 70% di nuclei del clone con delezione 13q14, e hanno diviso i casi di LLC del loro studio in quattro sottogruppi: pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1, pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, e pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1. Di questi, solo il primo gruppo manteneva una prognosi favorevole, mentre gli altri tre presentavano un decorso clinico simile alla LLC con cariotipo normale, con diminuzione di TFT e OS. La delezione di oltre il 70% di nuclei delle cellule del clone appare quindi come un marker indipendente di progressione, con impatto maggiore rispetto allāampiezza della delezione stessa. Tale dato veniva confermato da Van Dyke et al (Van Dyke DL et al, 2016), (dimostrando che i pazienti aventi >85% nuclei 13q- presentano unāevoluzione clinica peggiore, con TFT sovrapponibile a quelli aventi cariotipo normale o trisomia 12.
La minima regione deleta (MDR) del 13q include i loci DLEU2/MIR15A/MIR161, mentre nei casi con ampia delezione il segmento perso puĆ² comprendere anche il gene RB1 (banda 13q14.1-q14.2). Xiong et al (Xiong W et al, 2015) hanno dimostrato, mediante lāutilizzo di sonde specifiche per MDR e RB1 alla FISH, che i pazienti aventi unāampia delezione presentano TFT e OS nettamente piĆ¹ brevi rispetto ai pazienti aventi minima delezione. Tale dato veniva invece contraddetto dai ricercatori canadesi della British Columbia, i quali hanno evidenziato almeno 9 possibili combinazioni di delezione 13q14 a seconda dei geni deleti e della presenza dellāalterazione in entrambi gli alleli o meno. PiĆ¹ comunemente lāampia delezione risulta monoallelica (55%), fattore che potrebbe spiegare lāimpatto non significativo del coinvolgimento del gene RB1 nellāoutcome dei pazienti (Huang SJ et al, 2016). Pure Haferlach et al (Haferlach C et al, 2012) hanno dimostrato che lāampia delezione non influisce negativamente sul TFT. Data la discrepanza dei risultati ottenuti finora dai diversi studi, pertanto il significato prognostico dellāampiezza della delezione 13q14 risulta poco chiaro e rimane ad oggi unāinteressante questione scientifica.
In conclusione, il gruppo di pazienti con 13q- isolata parrebbe essere non omogeneo, in quanto recenti studi hanno messo in evidenza che la percentuale di cellule del clone che presentano nuclei deleti sia in grado di influenzare il decorso e la prognosi della malattia, con la conseguente necessitĆ di ridefinirne il rischio in base a tale parametro. Per quanto riguarda lāampiezza della delezione stessa, ulteriori studi sono necessari. Risulta evidente che lāimplicazione clinica della delezione 13q14 assume quindi un significato piĆ¹ complesso di quanto originariamente attribuitogli.