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INTRODUZIONE

 

Rispetto alla visione storica che definiva la leucemia linfatica cronica (LLC) una malattia indolente da accumulo di piccoli linfociti, le conoscenze patogenetiche hanno consentito di riconoscere questa condizione come una malattia dinamica, che trae la sua origine da una ricca serie di eventi biologici e genetici primari e secondari. L’interazione con gli antigeni, lo stato di “attivazione” cellulare che ne segue e le complesse interazioni con il microambiente plasmano una malattia dal decorso eterogeneo, talora preceduta da una condizione predisponente, la linfocitosi B-monoclonale (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL) recentemente definita nei suoi contorni nosografici. Grazie ai progressi sulla comprensione dei meccanismi che governano la storia naturale della LLC l’approccio moderno alla gestione del paziente si avvale di una caratterizzazione clinica che prevede lo studio di una serie di marcatori prognostici, molto utili per l’adeguata programmazione di terapie sempre più efficaci, che includono oggi alcune molecole in grado di interferire con processi essenziali per la sopravvivenza e la crescita del linfocito neoplastico.

 

Definizione e cenni epidemiologici

 

La LLC è un disordine linfoproliferativo cronico che coinvolge i linfociti B CD5-positivi e che rientra tra le neoplasie a cellule B-mature della classificazione WHO (Muller-Hermelink HK et al, 2008). E’ più frequente nei maschi che nelle femmine (1,5-2,0/1), ed ha un’incidenza nei paesi occidentali, riferita a 100.000 abitanti, compresa tra 2-6 casi/anno, mentre è rara in Giappone e nei paesi orientali, ove l’incidenza è <1 caso/100.000 abitanti (Redaelli A et al, 2004) (Figura Ia).

L’età media alla diagnosi è attorno ai 70 anni, e l’incidenza aumenta da 1 caso/anno/100.000 abitanti nella fascia 40-50 anni a 20 casi nella fascia 70-80 anni. Oltre il 40% delle LLC è diagnosticata ad un’età >75 anni, mentre meno del 10% è diagnosticata prima dei 50 anni (Brenner H et al, 2008) (Figura Ib).

 


Figura I. a) incidenza nei diversi paesi; b) incidenza per età

 

 

Eziologia

 

L’eziologia della LLC non è nota. Non può essere escluso un ruolo per le radiazioni ionizzanti (Richardson DB et al, 2005), anche se lo studio della popolazione sopravvissuta all’incidente nucleare di Chernobyl ha mostrato un aumento di incidenza di molte forme di leucemia, ma non di LLC (Lin SL et al, 2009). Alcune attività agricole, con particolare riguardo all’impiego di pesticidi si possono associare ad un aumento dei casi di LLC (Caporaso N et al, 2004).

Vi è evidenza di una possibile associazione tra LLC e fattori genetici. La LLC ha un’incidenza bassa nelle popolazioni orientali rispetto agli occidentali e i gruppi etnici che migrano in altri paesi mantengono l’incidenza di questa malattia al livello di quella del paese di provenienza. Nei parenti di primo grado di soggetti affetti da LLC il rischio di sviluppo della malattia e di altre sindromi linfoproliferative (linfoma di Hodgkin e non Hodgkin) è superiore rispetto a quello della popolazione generale di pari età e sesso (Capalbo S et al, 2000; Goldin LR et al, 2004) e si possono rinvenire espansioni di piccoli cloni B linfocitari con fenotipo classico della LLC e negatività per CD38, con una frequenza francamente maggiore rispetto alla popolazione generale (Rawstron AC et al, 2002). In un’analisi di 24 famiglie con più di due membri affetti si è potuto documentare, accanto alle classiche anomalie citogenetiche, una elevata frequenza di delezioni o guadagno di materiale genetico a livello delle bande Xp11.1-p21, Xq21-qter, 2p12-14 e 4q11-21 (Martin AJ et al, 2002). E’ possibile che, diversamente dal cancro mammario, ove un gene (BRCA1) ha un importantissimo effetto, il substrato genetico della LLC consista nell’intervento di più geni con basso potenziale predisponente (Goldin LR et al, 2007).

 

Patogenesi

 

A cura di: Sara Martinelli (Struttura semplice di Ematologia- Unità operativa di Medicina Interna – Ospedale S. Chiara di Trento).

La patogenesi della LLC riconosce numerosi momenti (Tabella I), incentrati sulle particolarità della cellula d’origine, sulle sue interazioni con ipotetici antigeni e con il microambiente e sullo sviluppo di una vasta gamma di lesioni genetiche.

 

Tabella I: Momenti patogenetici nella LLC

 

 

a) Cellula d’origine

 

Per molto tempo l’espressione del CD5 da parte delle cellule della LLC ha fatto ritenere che la controparte cellulare normale fosse rappresentata dal subset di linfociti B-1 (definito nel topo, senza un chiaro corrispettivo nell’uomo), coinvolto nell’immunità innata e in grado di produrre anticorpi naturali mediante una reazione T-indipendente (Darzentas N et al, 2010). Nell’uomo, l’espressione di CD5 caratterizza le cellule B vergini, mentre viene persa dopo l’incontro con l’antigene. In una parte dei casi di LLC (50-80% nelle varie casistiche) la cellula leucemica presenta >2% di mutazioni somatiche nella sequenza del gene codificante per la porzione variabile delle catene pesanti delle Ig (IGHV), un processo (ipermutazione somatica) che fisiologicamente avviene all’interno del centro germinativo, grazie all’intervento di enzimi quali l’activation-induced cytidine deaminase (AID), in risposta ad antigeni T-dipendenti. La restante parte delle LLC presenta una configurazione “germline” della porzione variabile del gene Ig (i.e. <2% di mutazioni). Il passaggio attraverso il centro germinativo, che quindi caratterizza le LLC “mutate”, è tuttavia incompatibile con la derivazione dai linfociti B-1. Inoltre, lo studio del profilo di espressione genica ha mostrato ampia omogeneità tra i diversi casi di LLC, indipendentemente dallo stato mutazionale dei geni IGHV, ed è risultato somigliante a quello delle cellule B memoria CD27+. I casi di LLC “mutate” potrebbero quindi rappresentare l’espansione di cellule B memoria CD27+ che, in seguito all’incontro con un antigene T-dipendente, hanno attraversato le fasi del centro germinativo; i casi di LLC “non mutate” potrebbero invece derivare da una frazione minoritaria di cellule B CD27+ che hanno incontrato l’antigene in maniera T-indipendente ed hanno sviluppato un fenotipo “memoria” senza passaggio attraverso il centro germinativo (Klein U et al, 2001; Rosenwald A et al, 2001). L’espressione del CD5 potrebbe essere coerente con l’origine delle LLC “mutate” da un subset recentemente riconosciuto di cellule B memoria CD27+ CD5+, mentre per le LLC “non mutate” l’espressione del CD5 sarebbe suggestiva di una origine da cellule B vergini pre-centro germinativo, ipotesi sostenuta anche da alcuni studi di espressione genica (Seifert M et al, 2012), non potendo tuttavia escludere che il fenotipo di superficie possa essere stato alterato dal processo stesso di trasformazione o da uno stato di anomala attivazione e che quindi il CD5 sia comunque espresso da cellule che hanno effettivamente incontrato l’antigene (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
Accanto alle controversie relative all’origine della cellula B matura la cui espansione determina la malattia, recenti evidenze suggeriscono che le più precoci alterazioni genetiche ed epigenetiche che predispongono allo sviluppo della LLC si verifichino a monte, a livello della cellula staminale emopoietica pluripotente (HSCs). Per effetto di queste lesioni precoci, la cui natura non è al momento chiara, il destino di questi progenitori viene orientato verso il lineage B linfocitario, con successiva selezione, per effetto della stimolazione antigenica, di elementi maturi della loro progenie che vanno incontro ad un’espansione prima oligoclonale, quindi monoclonale per accumulo di ulteriori lesioni genetiche (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).

 

b) Ruolo della stimolazione antigenica

 

E’ noto che il clone trasformato nella LLC presenta un utilizzo preferenziale di alcune famiglie V, D e J (ad esempio VH1-69; VH4-34), che non riflette la frequenza di questi riarrangiamenti nella popolazione B-linfocitaria CD5 normale. Poiché queste sequenze, assemblate durante la maturazione B-linfocitaria intramidollare, formano la porzione variabile del gene Ig espressa in superficie come BCR, si può dedurre che alcuni antigeni sono in grado di ingaggiare i cloni esprimenti questi BCR favorendone l’espansione e la successiva trasformazione. Questo concetto è stato rafforzato dalla dimostrazione di “BCR stereotipati”, che presentano una identica sequenza che codifica per la porzione del BCR che lega l’antigene nota come “complementarity determining region” (CDR) (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008; Ghiotto F et al, 2004; Tobin G et al, 2004) . Vista la complessità degli eventi di ricombinazione che portano all’assemblaggio del BCR, la probabilità che due linfociti B normali possano avere casualmente un BCR stereotipato è dell’ordine di 10-12, mentre è stato osservato che fino al 30 % dei casi di LLC può mostrare questo fenomeno (Stamatopoulos K et al, 2007). Tra gli antigeni in grado di ingaggiare il BCR nella LLC si annoverano gli elementi polisaccaridici batterici, il fattore reumatoide, il DNA, la cardiolipina, antigeni espressi sulle cellule apoptotiche (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008). Si è così affermato in questi ultimi anni il concetto di una relazione patogenetica tra stimolazione antigenica, spesso sostenuta da autoantigeni, e LLC17. In effetti è stata fornita una recente elegante dimostrazione di come una proteina, nota come “catena pesante della miosina non-muscolare” (non muscle myosin heavy chain), avente un ruolo nel movimento cellulare, possa essere esposta sulla superficie delle cellule apoptotiche e di come la maggior parte della LLC “non-mutate” possa riconoscere tramite i suoi anticorpi questo antigene (Chu CC et al, 2010).

Esiste inoltre dimostrazione che il linfocito della LLC può mantenere la capacità di rispondere all’antigene a) andando incontro in vivo a switch di classe Ig (Malisan F et al, 1996) b) sviluppando nuove mutazioni del gene IGHV (Gurrieri C et al, 2002), c) esprimendo l’enzima AID (Oppezzo P et al, 2003), importante nel processo di ipermutazione somatica; d) modificando il profilo di espressione genica e attivando il ciclo cellulare (Guarini A et al, 2008). E’ interessante notare che queste caratteristiche sono più spiccate nei casi di LLC “non-mutate” CD38+ e ZAP-70+, rispetto alle altre LLC (Lanham S et al, 2003; Chen L et al, 2002). In effetti, nelle LLC “non-mutate”, il BCR-signaling è attivo, mentre nelle forme “mutate” è inattivo in seguito ad uno stato di anergia funzionale legato ad una protratta stimolazione antigenica, con conseguente desensibilizzazione del BCR stesso (Stevenson FK et al, 2004). Questa condizione di “anergia” si associa ad uno specifico profilo di espressione di geni coinvolti nel signaling BCR-mediato (Muzio M et al, 2008).

Il BCR signaling derivante dalla stimolazione antigenica comporta il coinvolgimento di una serie di molecole che regolano la vita del linfocito neoplastico (Burger JA, 2011). Alcune di queste molecole quali la Bruton tirosin chinasi (BTK) e la subunità delta della fosfatidil-inositol-3 chinasi (PI3K delta), rappresentano bersagli per terapie mirate di dimostrata efficacia (Foà R et al, 2013).

Recentemente è stata inoltre dimostrata la capacità, esclusiva dei BCRs dei linfociti neoplastici in corso di LLC, di attivare la cascata di segnalazione intracellulare indipendentemente da una stimolazione antigenica (Dühren-von Minden M et al, 2012). Questa proprietà sembra essere strettamente dipendente dall’interazione delle regioni HCDR3 dei BCRs dei linfociti leucemici con specifici epitopi intrinseci degli stessi BCRs. Presumibilmente solo alcune sequenze HCDR3 e alcuni specifici epitopi intrinseci hanno questa peculiarità, il che potrebbe giustificare la selezione di un ristretto repertorio di BCRs ed il fenomeno dei recettori stereotipati. Pur non escludendo il probabile contributo di una selezione antigenica specifica, questa ipotesi fornisce una spiegazione alternativa, antigene-indipendente, del fenomeno, ed individua un potenziale nuovo target terapeutico nell’inibizione del signalling autonomo del BCR in pazienti con LLC (Dühren-von Minden M et al, 2012).

 

c) Turn-over cellulare

 

 Contrariamente a quanto ritenuto nel recente passato, la LLC non può essere oggi considerata una patologia da accumulo di linfociti che non vanno incontro ad apoptosi. I linfociti patologici mantengono la sensibilità ad alcuni stimoli pro-apoptotici mediati da Fas e dal legame di anticorpi anti IgM che ingaggiano il BCR (Chu P et al, 2002; Zupo S et al, 2002) e proliferano in vivo ad un ritmo pari allo 0,1-1% dell’intero clone ogni giorno (Messmer BT et al, 2005). Il ritmo di divisione cellulare e di rinnovo è più elevato nella frazione cellulare CD38+ (Calissano C et al, 2009).

 

d) Interazioni con il microambiente

 

Nei linfonodi dei soggetti con LLC esiste un comparto di “accumulo” costituito da piccoli linfociti ed un comparto, quello dei “centri di proliferazione”, ricco in paraimmunoblasti e prolinfociti, ove le cellule mostrano i caratteri dell’attivazione e vanno incontro a divisione cellulare. Queste strutture istologiche, che conferiscono un quadro pseudofollicolare al linfonodo della LLC, si rinvengono anche nei tessuti infiammati dei soggetti affetti da patologia autoimmune (Humby F et al, 2009) e richiamano il concetto del ruolo della stimolazione da parte di autoantigeni nella genesi della LLC. Nei centri di proliferazione i prolinfociti e i paraimmunoblasti sono a stretto contatto con linfociti T CD4 e cellule follicolari dendritiche. Nel comparto di “accumulo” i piccoli linfociti interagiscono con cellule stromali mesenchimali e con cellule “nutrici” (“nurselike cells”) differenziatesi da monociti circolanti, in un contesto di interazioni cellula-cellula che ne favorisce la sopravvivenza. In effetti, la stimolazione da parte del CD40 ha un ruolo nel mantenimento in vita del clone B-linfocitario, al pari dell’interazione con i linfociti T CD4, in grado di determinare la produzione di citochine anti-apoptotiche (IL4, IFN) (Ghia P, Caligaris-Cappio F, 2000). L’importanza in vivo della presenza dei linfociti T CD4 è stata recentemente dimostrata in un modello murino immunodeficiente, in cui il trasferimento di cellule LLC dava origine alla malattia solo in presenza di linfociti T CD4 autologhi (Bagnara D et al, 2011). Le cellule T sono reclutate nel microambiente tumorale da chemochine prodotte dalle cellule leucemiche e ne favoriscono la sopravvivenza tramite interazioni cellulari, in particolare il legame CD40-CD40L. Le cellule leucemiche esprimono inoltre recettori inibitori e producono molecole solubili in grado di rendere inefficace l’attività delle cellule T CD4, CD8 ed NK e sfuggire così alla sorveglianza immunitaria (ten Hacken E, Burger JA, 2014)
Nella distribuzione e sopravvivenza delle cellule patologiche (Stevenson FK, Caligaris-Cappio F, 2004) giocano un ruolo importante a) alcune chemochine e loro recettori, espressi dal linfocito leucemico (CXCR3 e CXCR5), b) cellule del sangue periferico in grado di differenziarsi in cellule “nutrici” (“nurselike”), che favoriscono la sopravvivenza e la migrazione del linfocito all’interno degli spazi midollari attraverso lo stromal-derived growth factor (Burger JA et al,1999), c) le cellule dendritiche, attraverso il CD44 e grazie all’induzione dell’espressione di una proteina BCL2 correlata (Mcl-1) (Pedersen IM et al, 2002). L’angiogenesi può giocare un ruolo nelle fasi di accelerazione della malattia o nei sottogruppi più aggressivi, ove si riscontrano livelli serici più elevati di VEGF (Molica S et al, 2002; Maffei R et al, 2010).

 

e) Lesioni citogenetico-molecolari

 

– geni microRNA e TCL1
Nella LLC non è ad oggi nota la lesione genetica primaria in grado di innescare il processo di trasformazione, ma sono disponibili numerose informazioni su una serie di lesioni che governano il processo di trasformazione (Figura II).

 

Cuneo_leucemia_linfatica_cronica_Figura_2

Figura II. Stimolazione antigenica e lesioni citogenetico-molecolari nella patogenesi della LLC

 

Sono stati localizzati due geni codificanti per microRNA (i.e miR-15 e miR-16) nella regione 13q14, deleta in un 40-50% delle LLC. Questi geni mostrano ridotta espressione in seguito a delezione nella LLC (Calin GA et al, 2002) e, in queste condizioni, può risultare alterata l’espressione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei linfociti B, in particolare il gene antiapoptotico BCL-2. In effetti, la delezione di miR-15 e miR-16 nel topo determina l’insorgenza di un’espansione clonale di linfociti B che presenta le caratteristiche biologiche della LLC. La proliferazione linfoide è più marcata e aggressiva se la delezione coinvolge, oltre ai suddetti geni a microRNA, il gene DLEU2 che mappa nella stessa regione (Klein U et al, 2010). La concomitante delezione di DLEU7, posizionato all’interno della regione di minima delezione, può contribuire alla patogenesi per la perdita/riduzione della sua fisiologica funzione di inibizione di NF-kB (Palamarchuk A et al, 2010).
Nella LLC, inoltre, vi è una consistente overespressione del gene TCL1 che mappa a livello della banda 14q32.1, determinata da un meccanismo di demetilazione del promotore (Yuille MR et al, 2001) e/o da due geni a microRNA, miR-29 and miR-181 (Efanov A et al, 2010). Esiste la documentazione che il topo transgenico per un costrutto che contiene l’enhancer del gene Ig ed il gene TCL1 sviluppa un’espansione clonale B-CD5+, che con il passare del tempo assume le caratteristiche della LLC (Bichi R et al, 2002). Analogamente, il topo transgenico che iperesprime miR-29 nei linfociti B, può sviluppare la LLC (Santanam U et al, 2010). Il ruolo di TCL1 nella patogenesi della LLC è mediato dalla riduzione dell’attività della DNA metiltansferasi 3A con conseguente diminuzione della metilazione del DNA (Palamarchuk A et al, 2012).
La famiglia dei miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) risulta frequentemente ipoespressa nella LLC. Questi geni a miRNA sono target trascrizionali diretti di p53 e sono coinvolti nel pathways dell’apoptosi p53-mediata. Ridotti livelli di miR-34, associati o meno a del17p/ mutazione TP53 o a delezione 11q (ove sono situati i geni che codificano per miR-34b e miR34c) si associano a forme di malattia più aggressiva (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Il profilo di espressione di numerosi altri miRNA (tra i quali miR21, miR181, miR155) riveste un ruolo prognostico nella LLC (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Studi recenti hanno dimostrato come diversi microRNA siano implicati a vario livello anche nella via di segnalazione del BCR e nelle interazioni con il microambiente (Balatti V et al, 2015), con un ruolo di regolazione della proliferazione e apoptosi delle cellule leucemiche che viene attualmente studiato come possibile target terapeutico (Bottoni A et al, 2016).

Mutazioni geniche ricorrenti
Il sequenziamento del genoma di pazienti affetti da LLC (Puente XS et al, 2011; Fabbri G et al, 2011)

ha dimostrato che la LLC si associa a mutazioni di tipo non-silente di numerosi geni, in grado di alterare la funzione delle corrispondenti proteine. Queste mutazioni appaiono più frequenti delle lesioni che comportano perdita o guadagno di materiale genico e sono in genere variabili da paziente a paziente pur potendosi individuare alcuni pathways comunemente coinvolti: regolazione del ciclo cellulare e apoptosi, risposta al danno del DNA, processazione del RNA, vie di segnalazione intracellulare (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). Alcune di queste lesioni sono ricorrenti:

  • Regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno del DNA: oltre alle lesioni di TP53, trattate nel paragrafo 17p-, e di ATM, trattate nel paragrafo 11q-, tra i geni coinvolti nella riparazione/protezione del DNA è risultato mutato in maniera ricorrente POT1, codificante una componente del sistema di mantenimento dei telomeri e mutato in circa il 3% dei pazienti con LLC, tutti appartenenti al sottogruppo con IGHV non mutato (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
  • Vie di segnalazione intracellulare: le lesioni di NOTCH1, presenti nel 10-15% dei casi, comportano l’accumulo di un’isoforma attiva della proteina che è in grado attivare il signalling intracellulare NOTCH1-correlato. I pazienti con questa mutazione presentano in genere una malattia relativamente aggressiva, associata al frequente sviluppo di farmacoresistenza e alla possibile tendenza all’evoluzione in sindrome di Richter . Le mutazioni di NOTCH1 sono più frequenti nei pazienti con IGHV non mutato e con la trisomia 12 (Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012).
  • Oltre alla mutazione del gene stesso, multiple lesioni genetiche ricorrenti in pazienti con LLC sembrano convergere sull’attivazione della via di NOTCH1, in particolare la mutazione inattivante di FBXW7, il cui prodotto interviene nella degradazione della proteina NOTCH1, e una mutazione nella regione non codificante 3’ UTR di NOTCH1 che ne altera lo splicing (Puente XS et al, 2015; Fabbri G et al, 2016). L’effettiva incidenza della deregolazione della via di NOTCH1 nella LLC potrebbe quindi essere sottostimata.
  • Diverse mutazioni ricorrenti nella LLC si traducono invece nell’attivazione del complesso trascrizionale NF-kB. BIRC3 codifica per una proteina che down-regola il signalling di NF-κB e presenta mutazioni inattivanti nel 20% circa delle LLC chemio-refrattarie. La frequenza di queste mutazioni è bassa (<5%) nelle fasi iniziali della malattia (Rossi D et al, 2012). Le lesioni di MYD88, rinvenute nel 5% dei casi e con maggior frequenza nelle LLC con geni IGHVmutati,  comportano la deregolazione di multipli pathways di segnalazione intracellulare con attivazione di target diversi tra cui NF-kB e STAT3 (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). In una piccola frazione di pazienti (1-3%), accomunati da un decorso aggressivo, risulta invece inattivato il gene NFKBIE che codifica un regolatore negativo diretto (IkBe) di NF-kB (Mansouri L et al, 2015).
  • Processazione RNA: Nel 5% delle LLC alla diagnosi si ritrovano mutazioni del gene SF3B1, che codifica per una proteina coinvolta nello splicing del RNA. Le conseguenze della mutazione di SF3B1 nella patogenesi della LLC sono state recentemente studiate con un’analisi trascrittomica che ha dimostrato l’alterazione di meccanismi di riparazione del DNA, di mantenimento delle sequenze telomeriche e, nuovamente, del signalling di NOTCH1 (Wang L et al, 2016). Queste mutazioni sono più frequenti nelle LLC con 11q- (Wang L et al, 2011), si associano ad uno stadio più avanzato, allo stato non mutato dei geni IGHV e alla positività per ZAP70 (Quesada V et al, 2011). Anche questa lesione, al pari delle mutazioni di NOTCH1 si rinviene più frequentemente nelle LLC chemiorefrattarie (Rossi D et al, 2011).

E’ interessante notare come le mutazioni di TP53NOTCH1SF3B1 e BIRC3 siano nella maggior parte dei casi mutualmente esclusive nei casi di LLC refrattari alla fludarabina, per cui è ragionevole ipotizzare che oltre a TP53, le vie del signaling di NOTCH1 ed NF-κB e il sistema dello splicing possano giocare un ruolo indipendente nella genesi della chemiorefrattarietà.

Il progresso delle tecniche di sequenziamento del DNA (next generation sequencing) ne ha consentito l’applicazione su grandi coorti di pazienti (Puente XS et al, 2015; Landau DA et al, 2015). Il sequenziamento dell’intero genoma codificante in 538 casi di LLC (Landau DA et al, 2015) ha individuato mutazioni ricorrenti a carico di due ulteriori pathways con ruolo patogenetico importante: i geni PTPN11 e FUBP1 sono modulatori dell’attività di MYC, mentre le mutazioni di NRAS, KRAS e BRAF implicano il coinvolgimento della via di segnalazione MAPK-ERK. Le lesioni ricorrenti di RPS15, coinvolto nel processo di splicing, e di IKZF3, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dei linfociti B, si sono rivelate mutazioni “driver” precedentemente non note nella patogenesi della malattia (Landau DA et al, 2015). Un dato estremamente interessante è emerso dal sequenziamento su larga scala (506 pazienti) anche delle regioni non codificanti del genoma dei casi di LLC, con l’identificazione di mutazioni ricorrenti in queste sequenze in grado di modificare l’espressione di geni codificanti. Le più rilevanti sono la mutazione ricorrente della regione 3’ UTR di NOTCH1, che ne altera il processo di splicing con delezione del dominio PEST e incremento della stabilità della proteina, e la mutazione a carico di una regione enhancer del cromosoma 9p13, che si associa ad una ridotta espressione del fattore di trascrizione PAX5, essenziale nel differenziamento B-linfocitario (Puente XS et al, 2015).

– Telomeri
I telomeri sono costituiti da sequenze ripetute di DNA che conferiscono stabilità alla struttura dei cromosomi. Con l’invecchiamento della cellula ed in seguito ai cicli replicativi a cui questa va incontro si assiste ad un accorciamento dei telomeri, che viene normalmente limitato dall’attività delle telomerasi. Nella LLC i telomeri dei linfociti patologici sono più corti rispetto ai linfociti B normali di soggetti di pari età e sesso. Inoltre l’accorciamento dei telomeri è più spiccato nelle LLC “non-mutate”, nelle quali si rinviene anche una maggiore attività telomerasica (Damle RN et al, 2004; Grabowski P et al, 2005) e si associa ad una prognosi sfavorevole e ad un’aumentata probabilità di sviluppare la sindrome di Richter (Rossi D et al, 2009). Queste osservazioni indicano come la storia replicativa della LLC sia differente a seconda dello stato mutazionale dei geni Ig e come nei casi più aggressivi vi sia stato uno stimolo proliferativo nelle fasi di emergenza del clone neoplastico in grado di indurre numerosi cicli di attivazione e replicazione con accorciamento, disfunzione e fusione dei telomeri e conseguente insorgenza di esteso danno del genoma (Lin TT et al, 2010).
Un recente lavoro di sequenziamento del genoma in pazienti con LLC familiare ha dimostrato la presenza di mutazioni germline proprio a carico di geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri (in particolare POT1), sottolineando come la disregolazione di questi fini meccanismi di protezione del DNA svolga un ruolo chiave nella patogenesi della LLC (Speedy HE et al, 2016).

 

Anomalie citogenetiche

 

L’introduzione della FISH ha permesso l’individuazione di aberrazioni cromosomiche in circa l’80% dei casi di LLC e ogni paziente viene oggi incluso in uno specifico gruppo in base a una classificazione citogenetica gerarchica che attribuisce importanza decrescente alle seguenti lesioni: 17p- > 11q- > +12 > 13q-. I risultanti gruppi citogenetici hanno una frequenza diversa a seconda dello stadio di malattia, come riportato in Tabella II.

 

Tabella II. Frequenza (% di casi) di aberrazioni cromosomiche alla FISH, di lesioni genetiche e stato mutazionale IGHV in >4000 casi di LLC arruolati nei protocolli del GCLLSG (*)

 

Recentemente, l’introduzione di una stimolazione efficace delle mitosi mediante oligonucleotidi e IL2 ha mostrato che approssimativamente il 30% delle LLC senza difetti cromosomici mediante analisi FISH in interfase può presentare una lesione cromosomica nel cariotipo all’analisi citogenetica e come questi pazienti “FISH normali” con anomalie citogenetiche nel cariotipo abbiano una prognosi sfavorevole (Rigolin GM et al, 2012). Inoltre, è stato dimostrato con questa tecnica che cariotipi complessi potevano essere documentati in una significativa frazione dei casi in associazione con fattori prognostici e quadro clinico sfavorevole (Haferlach C et al, 2007; Rigolin GM et al, 2015). Un quadro riassuntivo del significato delle principali lesioni citogenetiche è presentato in Tabella III.

 

Tabella III: Significato clinicobiologico dei difetti cromosomici ricorrenti nella LLC

 

Nuove sottili aberrazioni sono state identificate mediante sensibilissime tecniche di scansione dell’intero genoma, grazie alla quale sono state documentate lesioni genetiche in virtualmente tutti i casi di LLC (Grubor V et al, 2009).

 

13q-

 

A cura di: Danilo G. Faraci, Antonio Cuneo, Ematologia, Università di Ferrara

La delezione 13q14 è la più frequente anomalia citogenetica nella LLC e viene identificata alla FISH in più del 50% dei casi. Questa delezione è stata descritta come eterozigote in approssimativamente il 75-80% dei casi e omozigote nel restante 20-25%. Studi molecolari hanno dimostrato che la regione comunemente deleta comprende 790 kb tra i marcatori D13S1150 e D13S25.
Pekarsky et al (Pekarsky Y e Croce CM, 2015) hanno individuato tra i geni target della delezione 13q14, un cluster di 30 kb tra gli esoni 2 e 5 del gene DLEU2 codificante per due microRNA (miR-15a/miR-16-1) in grado di regolare la funzione di molteplici oncogeni, principale dei quali risulta essere BCL-2. Tale proteina, nella maggioranza dei casi di LLC, risulta overespressa, facendo intendere pertanto la funzione oncosoppressoria di miR-15a e miR-16-1. La delezione di questi geni per microRNA è stata recentemente confermata da altri ricercatori che hanno utilizzato CGH array ad alta risoluzione in 58 casi di LLC (Buhl AM et al, 2006).
Nel 2010, Klein et al (Klein U et al, 2010) hanno evidenziato che, se nel topo transgenico la delezione è ampia, coinvolgendo sia il cluster miR-15/16-1 che altri loci mappati su DLEU2, anche la malattia assume un decorso più grave, con una proliferazione linfoide più marcata ed aggressiva.
La categoria di pazienti che non presentano altre anomalie cromosomiche associate alla delezione 13q14 è quella a prognosi più favorevole con intervallo tra diagnosi e inizio del trattamento e sopravvivenza superiori rispetto alla LLC con cariotipo normale.
Tuttavia alcune differenze in termini di predittività del decorso clinico sono state osservate in rapporto a, i) delezione eterozigorte o omozigote, ii) grandezza del clone con delezione, iii) ampiezza delle delezione.
Garg R et al, 2012 hanno dimostrato che i pazienti con delezione eterozigote e quelli con delezione omozigote presentano un andamento clinico sovrapponibile. Tale evidenza smentirebbe precedenti ipotesi secondo le quale i pazienti omozigoti potrebbero presentare una maggiore cinetica di crescita linfocitaria rispetto agli eterozigoti.
Individui con un’alta percentuale di cellule con nuclei deleti sembrano avere un decorso più aggressivo della malattia, rientrando a tutti gli effetti nella categoria di rischio citogenetico intermedio (Van Dyke DL et al, 2010).
Dal Bo et al (Dal Bo M et al, 2011) hanno stabilito come cut-off il 70% di nuclei del clone con delezione 13q14, e hanno diviso i casi di LLC del loro studio in quattro sottogruppi: pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1, pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, e pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1. Di questi, solo il primo gruppo manteneva una prognosi favorevole, mentre gli altri tre presentavano un decorso clinico simile alla LLC con cariotipo normale, con diminuzione di TFT e OS. La delezione di oltre il 70% di nuclei delle cellule del clone appare quindi come un marker indipendente di progressione, con impatto maggiore rispetto all’ampiezza della delezione stessa. Tale dato veniva confermato da Van Dyke et al (Van Dyke DL et al, 2016), (dimostrando che i pazienti aventi >85% nuclei 13q- presentano un’evoluzione clinica peggiore, con TFT sovrapponibile a quelli aventi cariotipo normale o trisomia 12.
La minima regione deleta (MDR) del 13q include i loci DLEU2/MIR15A/MIR161, mentre nei casi con ampia delezione il segmento perso può comprendere anche il gene RB1 (banda 13q14.1-q14.2). Xiong et al (Xiong W et al, 2015) hanno dimostrato, mediante l’utilizzo di sonde specifiche per MDR e RB1 alla FISH, che i pazienti aventi un’ampia delezione presentano TFT e OS nettamente più brevi rispetto ai pazienti aventi minima delezione. Tale dato veniva invece contraddetto dai ricercatori canadesi della British Columbia, i quali hanno evidenziato almeno 9 possibili combinazioni di delezione 13q14 a seconda dei geni deleti e della presenza dell’alterazione in entrambi gli alleli o meno. Più comunemente l’ampia delezione risulta monoallelica (55%), fattore che potrebbe spiegare l’impatto non significativo del coinvolgimento del gene RB1 nell’outcome dei pazienti (Huang SJ et al, 2016). Pure Haferlach et al (Haferlach C et al, 2012) hanno dimostrato che l’ampia delezione non influisce negativamente sul TFT. Data la discrepanza dei risultati ottenuti finora dai diversi studi, pertanto il significato prognostico dell’ampiezza della delezione 13q14 risulta poco chiaro e rimane ad oggi un’interessante questione scientifica.
In conclusione, il gruppo di pazienti con 13q- isolata parrebbe essere non omogeneo, in quanto recenti studi hanno messo in evidenza che la percentuale di cellule del clone che presentano nuclei deleti sia in grado di influenzare il decorso e la prognosi della malattia, con la conseguente necessità di ridefinirne il rischio in base a tale parametro. Per quanto riguarda l’ampiezza della delezione stessa, ulteriori studi sono necessari. Risulta evidente che l’implicazione clinica della delezione 13q14 assume quindi un significato più complesso di quanto originariamente attribuitogli.

INTRODUZIONE

 

Rispetto alla visione storica che definiva la leucemia linfatica cronica (LLC) una malattia indolente da accumulo di piccoli linfociti, le conoscenze patogenetiche hanno consentito di riconoscere questa condizione come una malattia dinamica, che trae la sua origine da una ricca serie di eventi biologici e genetici primari e secondari. L’interazione con gli antigeni, lo stato di “attivazione” cellulare che ne segue e le complesse interazioni con il microambiente plasmano una malattia dal decorso eterogeneo, talora preceduta da una condizione predisponente, la linfocitosi B-monoclonale (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL) recentemente definita nei suoi contorni nosografici. Grazie ai progressi sulla comprensione dei meccanismi che governano la storia naturale della LLC l’approccio moderno alla gestione del paziente si avvale di una caratterizzazione clinica che prevede lo studio di una serie di marcatori prognostici, molto utili per l’adeguata programmazione di terapie sempre più efficaci, che includono oggi alcune molecole in grado di interferire con processi essenziali per la sopravvivenza e la crescita del linfocito neoplastico.

 

Definizione e cenni epidemiologici

 

La LLC è un disordine linfoproliferativo cronico che coinvolge i linfociti B CD5-positivi e che rientra tra le neoplasie a cellule B-mature della classificazione WHO (Muller-Hermelink HK et al, 2008). E’ più frequente nei maschi che nelle femmine (1,5-2,0/1), ed ha un’incidenza nei paesi occidentali, riferita a 100.000 abitanti, compresa tra 2-6 casi/anno, mentre è rara in Giappone e nei paesi orientali, ove l’incidenza è <1 caso/100.000 abitanti (Redaelli A et al, 2004) (Figura Ia).

L’età media alla diagnosi è attorno ai 70 anni, e l’incidenza aumenta da 1 caso/anno/100.000 abitanti nella fascia 40-50 anni a 20 casi nella fascia 70-80 anni. Oltre il 40% delle LLC è diagnosticata ad un’età >75 anni, mentre meno del 10% è diagnosticata prima dei 50 anni (Brenner H et al, 2008) (Figura Ib).

 


Figura I. a) incidenza nei diversi paesi; b) incidenza per età

 

 

Eziologia

 

L’eziologia della LLC non è nota. Non può essere escluso un ruolo per le radiazioni ionizzanti (Richardson DB et al, 2005), anche se lo studio della popolazione sopravvissuta all’incidente nucleare di Chernobyl ha mostrato un aumento di incidenza di molte forme di leucemia, ma non di LLC (Lin SL et al, 2009). Alcune attività agricole, con particolare riguardo all’impiego di pesticidi si possono associare ad un aumento dei casi di LLC (Caporaso N et al, 2004).

Vi è evidenza di una possibile associazione tra LLC e fattori genetici. La LLC ha un’incidenza bassa nelle popolazioni orientali rispetto agli occidentali e i gruppi etnici che migrano in altri paesi mantengono l’incidenza di questa malattia al livello di quella del paese di provenienza. Nei parenti di primo grado di soggetti affetti da LLC il rischio di sviluppo della malattia e di altre sindromi linfoproliferative (linfoma di Hodgkin e non Hodgkin) è superiore rispetto a quello della popolazione generale di pari età e sesso (Capalbo S et al, 2000; Goldin LR et al, 2004) e si possono rinvenire espansioni di piccoli cloni B linfocitari con fenotipo classico della LLC e negatività per CD38, con una frequenza francamente maggiore rispetto alla popolazione generale (Rawstron AC et al, 2002). In un’analisi di 24 famiglie con più di due membri affetti si è potuto documentare, accanto alle classiche anomalie citogenetiche, una elevata frequenza di delezioni o guadagno di materiale genetico a livello delle bande Xp11.1-p21, Xq21-qter, 2p12-14 e 4q11-21 (Martin AJ et al, 2002). E’ possibile che, diversamente dal cancro mammario, ove un gene (BRCA1) ha un importantissimo effetto, il substrato genetico della LLC consista nell’intervento di più geni con basso potenziale predisponente (Goldin LR et al, 2007).

 

Patogenesi

 

A cura di: Sara Martinelli (Struttura semplice di Ematologia- Unità operativa di Medicina Interna – Ospedale S. Chiara di Trento).

La patogenesi della LLC riconosce numerosi momenti (Tabella I), incentrati sulle particolarità della cellula d’origine, sulle sue interazioni con ipotetici antigeni e con il microambiente e sullo sviluppo di una vasta gamma di lesioni genetiche.

 

Tabella I: Momenti patogenetici nella LLC

 

 

a) Cellula d’origine

 

Per molto tempo l’espressione del CD5 da parte delle cellule della LLC ha fatto ritenere che la controparte cellulare normale fosse rappresentata dal subset di linfociti B-1 (definito nel topo, senza un chiaro corrispettivo nell’uomo), coinvolto nell’immunità innata e in grado di produrre anticorpi naturali mediante una reazione T-indipendente (Darzentas N et al, 2010). Nell’uomo, l’espressione di CD5 caratterizza le cellule B vergini, mentre viene persa dopo l’incontro con l’antigene. In una parte dei casi di LLC (50-80% nelle varie casistiche) la cellula leucemica presenta >2% di mutazioni somatiche nella sequenza del gene codificante per la porzione variabile delle catene pesanti delle Ig (IGHV), un processo (ipermutazione somatica) che fisiologicamente avviene all’interno del centro germinativo, grazie all’intervento di enzimi quali l’activation-induced cytidine deaminase (AID), in risposta ad antigeni T-dipendenti. La restante parte delle LLC presenta una configurazione “germline” della porzione variabile del gene Ig (i.e. <2% di mutazioni). Il passaggio attraverso il centro germinativo, che quindi caratterizza le LLC “mutate”, è tuttavia incompatibile con la derivazione dai linfociti B-1. Inoltre, lo studio del profilo di espressione genica ha mostrato ampia omogeneità tra i diversi casi di LLC, indipendentemente dallo stato mutazionale dei geni IGHV, ed è risultato somigliante a quello delle cellule B memoria CD27+. I casi di LLC “mutate” potrebbero quindi rappresentare l’espansione di cellule B memoria CD27+ che, in seguito all’incontro con un antigene T-dipendente, hanno attraversato le fasi del centro germinativo; i casi di LLC “non mutate” potrebbero invece derivare da una frazione minoritaria di cellule B CD27+ che hanno incontrato l’antigene in maniera T-indipendente ed hanno sviluppato un fenotipo “memoria” senza passaggio attraverso il centro germinativo (Klein U et al, 2001; Rosenwald A et al, 2001). L’espressione del CD5 potrebbe essere coerente con l’origine delle LLC “mutate” da un subset recentemente riconosciuto di cellule B memoria CD27+ CD5+, mentre per le LLC “non mutate” l’espressione del CD5 sarebbe suggestiva di una origine da cellule B vergini pre-centro germinativo, ipotesi sostenuta anche da alcuni studi di espressione genica (Seifert M et al, 2012), non potendo tuttavia escludere che il fenotipo di superficie possa essere stato alterato dal processo stesso di trasformazione o da uno stato di anomala attivazione e che quindi il CD5 sia comunque espresso da cellule che hanno effettivamente incontrato l’antigene (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
Accanto alle controversie relative all’origine della cellula B matura la cui espansione determina la malattia, recenti evidenze suggeriscono che le più precoci alterazioni genetiche ed epigenetiche che predispongono allo sviluppo della LLC si verifichino a monte, a livello della cellula staminale emopoietica pluripotente (HSCs). Per effetto di queste lesioni precoci, la cui natura non è al momento chiara, il destino di questi progenitori viene orientato verso il lineage B linfocitario, con successiva selezione, per effetto della stimolazione antigenica, di elementi maturi della loro progenie che vanno incontro ad un’espansione prima oligoclonale, quindi monoclonale per accumulo di ulteriori lesioni genetiche (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).

 

b) Ruolo della stimolazione antigenica

 

E’ noto che il clone trasformato nella LLC presenta un utilizzo preferenziale di alcune famiglie V, D e J (ad esempio VH1-69; VH4-34), che non riflette la frequenza di questi riarrangiamenti nella popolazione B-linfocitaria CD5 normale. Poiché queste sequenze, assemblate durante la maturazione B-linfocitaria intramidollare, formano la porzione variabile del gene Ig espressa in superficie come BCR, si può dedurre che alcuni antigeni sono in grado di ingaggiare i cloni esprimenti questi BCR favorendone l’espansione e la successiva trasformazione. Questo concetto è stato rafforzato dalla dimostrazione di “BCR stereotipati”, che presentano una identica sequenza che codifica per la porzione del BCR che lega l’antigene nota come “complementarity determining region” (CDR) (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008; Ghiotto F et al, 2004; Tobin G et al, 2004) . Vista la complessità degli eventi di ricombinazione che portano all’assemblaggio del BCR, la probabilità che due linfociti B normali possano avere casualmente un BCR stereotipato è dell’ordine di 10-12, mentre è stato osservato che fino al 30 % dei casi di LLC può mostrare questo fenomeno (Stamatopoulos K et al, 2007). Tra gli antigeni in grado di ingaggiare il BCR nella LLC si annoverano gli elementi polisaccaridici batterici, il fattore reumatoide, il DNA, la cardiolipina, antigeni espressi sulle cellule apoptotiche (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008). Si è così affermato in questi ultimi anni il concetto di una relazione patogenetica tra stimolazione antigenica, spesso sostenuta da autoantigeni, e LLC17. In effetti è stata fornita una recente elegante dimostrazione di come una proteina, nota come “catena pesante della miosina non-muscolare” (non muscle myosin heavy chain), avente un ruolo nel movimento cellulare, possa essere esposta sulla superficie delle cellule apoptotiche e di come la maggior parte della LLC “non-mutate” possa riconoscere tramite i suoi anticorpi questo antigene (Chu CC et al, 2010).

Esiste inoltre dimostrazione che il linfocito della LLC può mantenere la capacità di rispondere all’antigene a) andando incontro in vivo a switch di classe Ig (Malisan F et al, 1996) b) sviluppando nuove mutazioni del gene IGHV (Gurrieri C et al, 2002), c) esprimendo l’enzima AID (Oppezzo P et al, 2003), importante nel processo di ipermutazione somatica; d) modificando il profilo di espressione genica e attivando il ciclo cellulare (Guarini A et al, 2008). E’ interessante notare che queste caratteristiche sono più spiccate nei casi di LLC “non-mutate” CD38+ e ZAP-70+, rispetto alle altre LLC (Lanham S et al, 2003; Chen L et al, 2002). In effetti, nelle LLC “non-mutate”, il BCR-signaling è attivo, mentre nelle forme “mutate” è inattivo in seguito ad uno stato di anergia funzionale legato ad una protratta stimolazione antigenica, con conseguente desensibilizzazione del BCR stesso (Stevenson FK et al, 2004). Questa condizione di “anergia” si associa ad uno specifico profilo di espressione di geni coinvolti nel signaling BCR-mediato (Muzio M et al, 2008).

Il BCR signaling derivante dalla stimolazione antigenica comporta il coinvolgimento di una serie di molecole che regolano la vita del linfocito neoplastico (Burger JA, 2011). Alcune di queste molecole quali la Bruton tirosin chinasi (BTK) e la subunità delta della fosfatidil-inositol-3 chinasi (PI3K delta), rappresentano bersagli per terapie mirate di dimostrata efficacia (Foà R et al, 2013).

Recentemente è stata inoltre dimostrata la capacità, esclusiva dei BCRs dei linfociti neoplastici in corso di LLC, di attivare la cascata di segnalazione intracellulare indipendentemente da una stimolazione antigenica (Dühren-von Minden M et al, 2012). Questa proprietà sembra essere strettamente dipendente dall’interazione delle regioni HCDR3 dei BCRs dei linfociti leucemici con specifici epitopi intrinseci degli stessi BCRs. Presumibilmente solo alcune sequenze HCDR3 e alcuni specifici epitopi intrinseci hanno questa peculiarità, il che potrebbe giustificare la selezione di un ristretto repertorio di BCRs ed il fenomeno dei recettori stereotipati. Pur non escludendo il probabile contributo di una selezione antigenica specifica, questa ipotesi fornisce una spiegazione alternativa, antigene-indipendente, del fenomeno, ed individua un potenziale nuovo target terapeutico nell’inibizione del signalling autonomo del BCR in pazienti con LLC (Dühren-von Minden M et al, 2012).

 

c) Turn-over cellulare

 

 Contrariamente a quanto ritenuto nel recente passato, la LLC non può essere oggi considerata una patologia da accumulo di linfociti che non vanno incontro ad apoptosi. I linfociti patologici mantengono la sensibilità ad alcuni stimoli pro-apoptotici mediati da Fas e dal legame di anticorpi anti IgM che ingaggiano il BCR (Chu P et al, 2002; Zupo S et al, 2002) e proliferano in vivo ad un ritmo pari allo 0,1-1% dell’intero clone ogni giorno (Messmer BT et al, 2005). Il ritmo di divisione cellulare e di rinnovo è più elevato nella frazione cellulare CD38+ (Calissano C et al, 2009).

 

d) Interazioni con il microambiente

 

Nei linfonodi dei soggetti con LLC esiste un comparto di “accumulo” costituito da piccoli linfociti ed un comparto, quello dei “centri di proliferazione”, ricco in paraimmunoblasti e prolinfociti, ove le cellule mostrano i caratteri dell’attivazione e vanno incontro a divisione cellulare. Queste strutture istologiche, che conferiscono un quadro pseudofollicolare al linfonodo della LLC, si rinvengono anche nei tessuti infiammati dei soggetti affetti da patologia autoimmune (Humby F et al, 2009) e richiamano il concetto del ruolo della stimolazione da parte di autoantigeni nella genesi della LLC. Nei centri di proliferazione i prolinfociti e i paraimmunoblasti sono a stretto contatto con linfociti T CD4 e cellule follicolari dendritiche. Nel comparto di “accumulo” i piccoli linfociti interagiscono con cellule stromali mesenchimali e con cellule “nutrici” (“nurselike cells”) differenziatesi da monociti circolanti, in un contesto di interazioni cellula-cellula che ne favorisce la sopravvivenza. In effetti, la stimolazione da parte del CD40 ha un ruolo nel mantenimento in vita del clone B-linfocitario, al pari dell’interazione con i linfociti T CD4, in grado di determinare la produzione di citochine anti-apoptotiche (IL4, IFN) (Ghia P, Caligaris-Cappio F, 2000). L’importanza in vivo della presenza dei linfociti T CD4 è stata recentemente dimostrata in un modello murino immunodeficiente, in cui il trasferimento di cellule LLC dava origine alla malattia solo in presenza di linfociti T CD4 autologhi (Bagnara D et al, 2011). Le cellule T sono reclutate nel microambiente tumorale da chemochine prodotte dalle cellule leucemiche e ne favoriscono la sopravvivenza tramite interazioni cellulari, in particolare il legame CD40-CD40L. Le cellule leucemiche esprimono inoltre recettori inibitori e producono molecole solubili in grado di rendere inefficace l’attività delle cellule T CD4, CD8 ed NK e sfuggire così alla sorveglianza immunitaria (ten Hacken E, Burger JA, 2014)
Nella distribuzione e sopravvivenza delle cellule patologiche (Stevenson FK, Caligaris-Cappio F, 2004) giocano un ruolo importante a) alcune chemochine e loro recettori, espressi dal linfocito leucemico (CXCR3 e CXCR5), b) cellule del sangue periferico in grado di differenziarsi in cellule “nutrici” (“nurselike”), che favoriscono la sopravvivenza e la migrazione del linfocito all’interno degli spazi midollari attraverso lo stromal-derived growth factor (Burger JA et al,1999), c) le cellule dendritiche, attraverso il CD44 e grazie all’induzione dell’espressione di una proteina BCL2 correlata (Mcl-1) (Pedersen IM et al, 2002). L’angiogenesi può giocare un ruolo nelle fasi di accelerazione della malattia o nei sottogruppi più aggressivi, ove si riscontrano livelli serici più elevati di VEGF (Molica S et al, 2002; Maffei R et al, 2010).

 

e) Lesioni citogenetico-molecolari

 

– geni microRNA e TCL1
Nella LLC non è ad oggi nota la lesione genetica primaria in grado di innescare il processo di trasformazione, ma sono disponibili numerose informazioni su una serie di lesioni che governano il processo di trasformazione (Figura II).

 

Cuneo_leucemia_linfatica_cronica_Figura_2

Figura II. Stimolazione antigenica e lesioni citogenetico-molecolari nella patogenesi della LLC

 

Sono stati localizzati due geni codificanti per microRNA (i.e miR-15 e miR-16) nella regione 13q14, deleta in un 40-50% delle LLC. Questi geni mostrano ridotta espressione in seguito a delezione nella LLC (Calin GA et al, 2002) e, in queste condizioni, può risultare alterata l’espressione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei linfociti B, in particolare il gene antiapoptotico BCL-2. In effetti, la delezione di miR-15 e miR-16 nel topo determina l’insorgenza di un’espansione clonale di linfociti B che presenta le caratteristiche biologiche della LLC. La proliferazione linfoide è più marcata e aggressiva se la delezione coinvolge, oltre ai suddetti geni a microRNA, il gene DLEU2 che mappa nella stessa regione (Klein U et al, 2010). La concomitante delezione di DLEU7, posizionato all’interno della regione di minima delezione, può contribuire alla patogenesi per la perdita/riduzione della sua fisiologica funzione di inibizione di NF-kB (Palamarchuk A et al, 2010).
Nella LLC, inoltre, vi è una consistente overespressione del gene TCL1 che mappa a livello della banda 14q32.1, determinata da un meccanismo di demetilazione del promotore (Yuille MR et al, 2001) e/o da due geni a microRNA, miR-29 and miR-181 (Efanov A et al, 2010). Esiste la documentazione che il topo transgenico per un costrutto che contiene l’enhancer del gene Ig ed il gene TCL1 sviluppa un’espansione clonale B-CD5+, che con il passare del tempo assume le caratteristiche della LLC (Bichi R et al, 2002). Analogamente, il topo transgenico che iperesprime miR-29 nei linfociti B, può sviluppare la LLC (Santanam U et al, 2010). Il ruolo di TCL1 nella patogenesi della LLC è mediato dalla riduzione dell’attività della DNA metiltansferasi 3A con conseguente diminuzione della metilazione del DNA (Palamarchuk A et al, 2012).
La famiglia dei miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) risulta frequentemente ipoespressa nella LLC. Questi geni a miRNA sono target trascrizionali diretti di p53 e sono coinvolti nel pathways dell’apoptosi p53-mediata. Ridotti livelli di miR-34, associati o meno a del17p/ mutazione TP53 o a delezione 11q (ove sono situati i geni che codificano per miR-34b e miR34c) si associano a forme di malattia più aggressiva (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Il profilo di espressione di numerosi altri miRNA (tra i quali miR21, miR181, miR155) riveste un ruolo prognostico nella LLC (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Studi recenti hanno dimostrato come diversi microRNA siano implicati a vario livello anche nella via di segnalazione del BCR e nelle interazioni con il microambiente (Balatti V et al, 2015), con un ruolo di regolazione della proliferazione e apoptosi delle cellule leucemiche che viene attualmente studiato come possibile target terapeutico (Bottoni A et al, 2016).

Mutazioni geniche ricorrenti
Il sequenziamento del genoma di pazienti affetti da LLC (Puente XS et al, 2011; Fabbri G et al, 2011)

ha dimostrato che la LLC si associa a mutazioni di tipo non-silente di numerosi geni, in grado di alterare la funzione delle corrispondenti proteine. Queste mutazioni appaiono più frequenti delle lesioni che comportano perdita o guadagno di materiale genico e sono in genere variabili da paziente a paziente pur potendosi individuare alcuni pathways comunemente coinvolti: regolazione del ciclo cellulare e apoptosi, risposta al danno del DNA, processazione del RNA, vie di segnalazione intracellulare (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). Alcune di queste lesioni sono ricorrenti:

  • Regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno del DNA: oltre alle lesioni di TP53, trattate nel paragrafo 17p-, e di ATM, trattate nel paragrafo 11q-, tra i geni coinvolti nella riparazione/protezione del DNA è risultato mutato in maniera ricorrente POT1, codificante una componente del sistema di mantenimento dei telomeri e mutato in circa il 3% dei pazienti con LLC, tutti appartenenti al sottogruppo con IGHV non mutato (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
  • Vie di segnalazione intracellulare: le lesioni di NOTCH1, presenti nel 10-15% dei casi, comportano l’accumulo di un’isoforma attiva della proteina che è in grado attivare il signalling intracellulare NOTCH1-correlato. I pazienti con questa mutazione presentano in genere una malattia relativamente aggressiva, associata al frequente sviluppo di farmacoresistenza e alla possibile tendenza all’evoluzione in sindrome di Richter . Le mutazioni di NOTCH1 sono più frequenti nei pazienti con IGHV non mutato e con la trisomia 12 (Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012).
  • Oltre alla mutazione del gene stesso, multiple lesioni genetiche ricorrenti in pazienti con LLC sembrano convergere sull’attivazione della via di NOTCH1, in particolare la mutazione inattivante di FBXW7, il cui prodotto interviene nella degradazione della proteina NOTCH1, e una mutazione nella regione non codificante 3’ UTR di NOTCH1 che ne altera lo splicing (Puente XS et al, 2015; Fabbri G et al, 2016). L’effettiva incidenza della deregolazione della via di NOTCH1 nella LLC potrebbe quindi essere sottostimata.
  • Diverse mutazioni ricorrenti nella LLC si traducono invece nell’attivazione del complesso trascrizionale NF-kB. BIRC3 codifica per una proteina che down-regola il signalling di NF-κB e presenta mutazioni inattivanti nel 20% circa delle LLC chemio-refrattarie. La frequenza di queste mutazioni è bassa (<5%) nelle fasi iniziali della malattia (Rossi D et al, 2012). Le lesioni di MYD88, rinvenute nel 5% dei casi e con maggior frequenza nelle LLC con geni IGHVmutati,  comportano la deregolazione di multipli pathways di segnalazione intracellulare con attivazione di target diversi tra cui NF-kB e STAT3 (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). In una piccola frazione di pazienti (1-3%), accomunati da un decorso aggressivo, risulta invece inattivato il gene NFKBIE che codifica un regolatore negativo diretto (IkBe) di NF-kB (Mansouri L et al, 2015).
  • Processazione RNA: Nel 5% delle LLC alla diagnosi si ritrovano mutazioni del gene SF3B1, che codifica per una proteina coinvolta nello splicing del RNA. Le conseguenze della mutazione di SF3B1 nella patogenesi della LLC sono state recentemente studiate con un’analisi trascrittomica che ha dimostrato l’alterazione di meccanismi di riparazione del DNA, di mantenimento delle sequenze telomeriche e, nuovamente, del signalling di NOTCH1 (Wang L et al, 2016). Queste mutazioni sono più frequenti nelle LLC con 11q- (Wang L et al, 2011), si associano ad uno stadio più avanzato, allo stato non mutato dei geni IGHV e alla positività per ZAP70 (Quesada V et al, 2011). Anche questa lesione, al pari delle mutazioni di NOTCH1 si rinviene più frequentemente nelle LLC chemiorefrattarie (Rossi D et al, 2011).

E’ interessante notare come le mutazioni di TP53NOTCH1SF3B1 e BIRC3 siano nella maggior parte dei casi mutualmente esclusive nei casi di LLC refrattari alla fludarabina, per cui è ragionevole ipotizzare che oltre a TP53, le vie del signaling di NOTCH1 ed NF-κB e il sistema dello splicing possano giocare un ruolo indipendente nella genesi della chemiorefrattarietà.

Il progresso delle tecniche di sequenziamento del DNA (next generation sequencing) ne ha consentito l’applicazione su grandi coorti di pazienti (Puente XS et al, 2015; Landau DA et al, 2015). Il sequenziamento dell’intero genoma codificante in 538 casi di LLC (Landau DA et al, 2015) ha individuato mutazioni ricorrenti a carico di due ulteriori pathways con ruolo patogenetico importante: i geni PTPN11 e FUBP1 sono modulatori dell’attività di MYC, mentre le mutazioni di NRAS, KRAS e BRAF implicano il coinvolgimento della via di segnalazione MAPK-ERK. Le lesioni ricorrenti di RPS15, coinvolto nel processo di splicing, e di IKZF3, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dei linfociti B, si sono rivelate mutazioni “driver” precedentemente non note nella patogenesi della malattia (Landau DA et al, 2015). Un dato estremamente interessante è emerso dal sequenziamento su larga scala (506 pazienti) anche delle regioni non codificanti del genoma dei casi di LLC, con l’identificazione di mutazioni ricorrenti in queste sequenze in grado di modificare l’espressione di geni codificanti. Le più rilevanti sono la mutazione ricorrente della regione 3’ UTR di NOTCH1, che ne altera il processo di splicing con delezione del dominio PEST e incremento della stabilità della proteina, e la mutazione a carico di una regione enhancer del cromosoma 9p13, che si associa ad una ridotta espressione del fattore di trascrizione PAX5, essenziale nel differenziamento B-linfocitario (Puente XS et al, 2015).

– Telomeri
I telomeri sono costituiti da sequenze ripetute di DNA che conferiscono stabilità alla struttura dei cromosomi. Con l’invecchiamento della cellula ed in seguito ai cicli replicativi a cui questa va incontro si assiste ad un accorciamento dei telomeri, che viene normalmente limitato dall’attività delle telomerasi. Nella LLC i telomeri dei linfociti patologici sono più corti rispetto ai linfociti B normali di soggetti di pari età e sesso. Inoltre l’accorciamento dei telomeri è più spiccato nelle LLC “non-mutate”, nelle quali si rinviene anche una maggiore attività telomerasica (Damle RN et al, 2004; Grabowski P et al, 2005) e si associa ad una prognosi sfavorevole e ad un’aumentata probabilità di sviluppare la sindrome di Richter (Rossi D et al, 2009). Queste osservazioni indicano come la storia replicativa della LLC sia differente a seconda dello stato mutazionale dei geni Ig e come nei casi più aggressivi vi sia stato uno stimolo proliferativo nelle fasi di emergenza del clone neoplastico in grado di indurre numerosi cicli di attivazione e replicazione con accorciamento, disfunzione e fusione dei telomeri e conseguente insorgenza di esteso danno del genoma (Lin TT et al, 2010).
Un recente lavoro di sequenziamento del genoma in pazienti con LLC familiare ha dimostrato la presenza di mutazioni germline proprio a carico di geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri (in particolare POT1), sottolineando come la disregolazione di questi fini meccanismi di protezione del DNA svolga un ruolo chiave nella patogenesi della LLC (Speedy HE et al, 2016).

 

Anomalie citogenetiche

 

L’introduzione della FISH ha permesso l’individuazione di aberrazioni cromosomiche in circa l’80% dei casi di LLC e ogni paziente viene oggi incluso in uno specifico gruppo in base a una classificazione citogenetica gerarchica che attribuisce importanza decrescente alle seguenti lesioni: 17p- > 11q- > +12 > 13q-. I risultanti gruppi citogenetici hanno una frequenza diversa a seconda dello stadio di malattia, come riportato in Tabella II.

 

Tabella II. Frequenza (% di casi) di aberrazioni cromosomiche alla FISH, di lesioni genetiche e stato mutazionale IGHV in >4000 casi di LLC arruolati nei protocolli del GCLLSG (*)

 

Recentemente, l’introduzione di una stimolazione efficace delle mitosi mediante oligonucleotidi e IL2 ha mostrato che approssimativamente il 30% delle LLC senza difetti cromosomici mediante analisi FISH in interfase può presentare una lesione cromosomica nel cariotipo all’analisi citogenetica e come questi pazienti “FISH normali” con anomalie citogenetiche nel cariotipo abbiano una prognosi sfavorevole (Rigolin GM et al, 2012). Inoltre, è stato dimostrato con questa tecnica che cariotipi complessi potevano essere documentati in una significativa frazione dei casi in associazione con fattori prognostici e quadro clinico sfavorevole (Haferlach C et al, 2007; Rigolin GM et al, 2015). Un quadro riassuntivo del significato delle principali lesioni citogenetiche è presentato in Tabella III.

 

Tabella III: Significato clinicobiologico dei difetti cromosomici ricorrenti nella LLC

 

Nuove sottili aberrazioni sono state identificate mediante sensibilissime tecniche di scansione dell’intero genoma, grazie alla quale sono state documentate lesioni genetiche in virtualmente tutti i casi di LLC (Grubor V et al, 2009).

 

13q-

 

A cura di: Danilo G. Faraci, Antonio Cuneo, Ematologia, Università di Ferrara

La delezione 13q14 è la più frequente anomalia citogenetica nella LLC e viene identificata alla FISH in più del 50% dei casi. Questa delezione è stata descritta come eterozigote in approssimativamente il 75-80% dei casi e omozigote nel restante 20-25%. Studi molecolari hanno dimostrato che la regione comunemente deleta comprende 790 kb tra i marcatori D13S1150 e D13S25.
Pekarsky et al (Pekarsky Y e Croce CM, 2015) hanno individuato tra i geni target della delezione 13q14, un cluster di 30 kb tra gli esoni 2 e 5 del gene DLEU2 codificante per due microRNA (miR-15a/miR-16-1) in grado di regolare la funzione di molteplici oncogeni, principale dei quali risulta essere BCL-2. Tale proteina, nella maggioranza dei casi di LLC, risulta overespressa, facendo intendere pertanto la funzione oncosoppressoria di miR-15a e miR-16-1. La delezione di questi geni per microRNA è stata recentemente confermata da altri ricercatori che hanno utilizzato CGH array ad alta risoluzione in 58 casi di LLC (Buhl AM et al, 2006).
Nel 2010, Klein et al (Klein U et al, 2010) hanno evidenziato che, se nel topo transgenico la delezione è ampia, coinvolgendo sia il cluster miR-15/16-1 che altri loci mappati su DLEU2, anche la malattia assume un decorso più grave, con una proliferazione linfoide più marcata ed aggressiva.
La categoria di pazienti che non presentano altre anomalie cromosomiche associate alla delezione 13q14 è quella a prognosi più favorevole con intervallo tra diagnosi e inizio del trattamento e sopravvivenza superiori rispetto alla LLC con cariotipo normale.
Tuttavia alcune differenze in termini di predittività del decorso clinico sono state osservate in rapporto a, i) delezione eterozigorte o omozigote, ii) grandezza del clone con delezione, iii) ampiezza delle delezione.
Garg R et al, 2012 hanno dimostrato che i pazienti con delezione eterozigote e quelli con delezione omozigote presentano un andamento clinico sovrapponibile. Tale evidenza smentirebbe precedenti ipotesi secondo le quale i pazienti omozigoti potrebbero presentare una maggiore cinetica di crescita linfocitaria rispetto agli eterozigoti.
Individui con un’alta percentuale di cellule con nuclei deleti sembrano avere un decorso più aggressivo della malattia, rientrando a tutti gli effetti nella categoria di rischio citogenetico intermedio (Van Dyke DL et al, 2010).
Dal Bo et al (Dal Bo M et al, 2011) hanno stabilito come cut-off il 70% di nuclei del clone con delezione 13q14, e hanno diviso i casi di LLC del loro studio in quattro sottogruppi: pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1, pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, e pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1. Di questi, solo il primo gruppo manteneva una prognosi favorevole, mentre gli altri tre presentavano un decorso clinico simile alla LLC con cariotipo normale, con diminuzione di TFT e OS. La delezione di oltre il 70% di nuclei delle cellule del clone appare quindi come un marker indipendente di progressione, con impatto maggiore rispetto all’ampiezza della delezione stessa. Tale dato veniva confermato da Van Dyke et al (Van Dyke DL et al, 2016), (dimostrando che i pazienti aventi >85% nuclei 13q- presentano un’evoluzione clinica peggiore, con TFT sovrapponibile a quelli aventi cariotipo normale o trisomia 12.
La minima regione deleta (MDR) del 13q include i loci DLEU2/MIR15A/MIR161, mentre nei casi con ampia delezione il segmento perso può comprendere anche il gene RB1 (banda 13q14.1-q14.2). Xiong et al (Xiong W et al, 2015) hanno dimostrato, mediante l’utilizzo di sonde specifiche per MDR e RB1 alla FISH, che i pazienti aventi un’ampia delezione presentano TFT e OS nettamente più brevi rispetto ai pazienti aventi minima delezione. Tale dato veniva invece contraddetto dai ricercatori canadesi della British Columbia, i quali hanno evidenziato almeno 9 possibili combinazioni di delezione 13q14 a seconda dei geni deleti e della presenza dell’alterazione in entrambi gli alleli o meno. Più comunemente l’ampia delezione risulta monoallelica (55%), fattore che potrebbe spiegare l’impatto non significativo del coinvolgimento del gene RB1 nell’outcome dei pazienti (Huang SJ et al, 2016). Pure Haferlach et al (Haferlach C et al, 2012) hanno dimostrato che l’ampia delezione non influisce negativamente sul TFT. Data la discrepanza dei risultati ottenuti finora dai diversi studi, pertanto il significato prognostico dell’ampiezza della delezione 13q14 risulta poco chiaro e rimane ad oggi un’interessante questione scientifica.
In conclusione, il gruppo di pazienti con 13q- isolata parrebbe essere non omogeneo, in quanto recenti studi hanno messo in evidenza che la percentuale di cellule del clone che presentano nuclei deleti sia in grado di influenzare il decorso e la prognosi della malattia, con la conseguente necessità di ridefinirne il rischio in base a tale parametro. Per quanto riguarda l’ampiezza della delezione stessa, ulteriori studi sono necessari. Risulta evidente che l’implicazione clinica della delezione 13q14 assume quindi un significato più complesso di quanto originariamente attribuitogli.

INTRODUZIONE

 

Rispetto alla visione storica che definiva la leucemia linfatica cronica (LLC) una malattia indolente da accumulo di piccoli linfociti, le conoscenze patogenetiche hanno consentito di riconoscere questa condizione come una malattia dinamica, che trae la sua origine da una ricca serie di eventi biologici e genetici primari e secondari. L’interazione con gli antigeni, lo stato di “attivazione” cellulare che ne segue e le complesse interazioni con il microambiente plasmano una malattia dal decorso eterogeneo, talora preceduta da una condizione predisponente, la linfocitosi B-monoclonale (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL) recentemente definita nei suoi contorni nosografici. Grazie ai progressi sulla comprensione dei meccanismi che governano la storia naturale della LLC l’approccio moderno alla gestione del paziente si avvale di una caratterizzazione clinica che prevede lo studio di una serie di marcatori prognostici, molto utili per l’adeguata programmazione di terapie sempre più efficaci, che includono oggi alcune molecole in grado di interferire con processi essenziali per la sopravvivenza e la crescita del linfocito neoplastico.

 

Definizione e cenni epidemiologici

 

La LLC è un disordine linfoproliferativo cronico che coinvolge i linfociti B CD5-positivi e che rientra tra le neoplasie a cellule B-mature della classificazione WHO (Muller-Hermelink HK et al, 2008). E’ più frequente nei maschi che nelle femmine (1,5-2,0/1), ed ha un’incidenza nei paesi occidentali, riferita a 100.000 abitanti, compresa tra 2-6 casi/anno, mentre è rara in Giappone e nei paesi orientali, ove l’incidenza è <1 caso/100.000 abitanti (Redaelli A et al, 2004) (Figura Ia).

L’età media alla diagnosi è attorno ai 70 anni, e l’incidenza aumenta da 1 caso/anno/100.000 abitanti nella fascia 40-50 anni a 20 casi nella fascia 70-80 anni. Oltre il 40% delle LLC è diagnosticata ad un’età >75 anni, mentre meno del 10% è diagnosticata prima dei 50 anni (Brenner H et al, 2008) (Figura Ib).

 


Figura I. a) incidenza nei diversi paesi; b) incidenza per età

 

 

Eziologia

 

L’eziologia della LLC non è nota. Non può essere escluso un ruolo per le radiazioni ionizzanti (Richardson DB et al, 2005), anche se lo studio della popolazione sopravvissuta all’incidente nucleare di Chernobyl ha mostrato un aumento di incidenza di molte forme di leucemia, ma non di LLC (Lin SL et al, 2009). Alcune attività agricole, con particolare riguardo all’impiego di pesticidi si possono associare ad un aumento dei casi di LLC (Caporaso N et al, 2004).

Vi è evidenza di una possibile associazione tra LLC e fattori genetici. La LLC ha un’incidenza bassa nelle popolazioni orientali rispetto agli occidentali e i gruppi etnici che migrano in altri paesi mantengono l’incidenza di questa malattia al livello di quella del paese di provenienza. Nei parenti di primo grado di soggetti affetti da LLC il rischio di sviluppo della malattia e di altre sindromi linfoproliferative (linfoma di Hodgkin e non Hodgkin) è superiore rispetto a quello della popolazione generale di pari età e sesso (Capalbo S et al, 2000; Goldin LR et al, 2004) e si possono rinvenire espansioni di piccoli cloni B linfocitari con fenotipo classico della LLC e negatività per CD38, con una frequenza francamente maggiore rispetto alla popolazione generale (Rawstron AC et al, 2002). In un’analisi di 24 famiglie con più di due membri affetti si è potuto documentare, accanto alle classiche anomalie citogenetiche, una elevata frequenza di delezioni o guadagno di materiale genetico a livello delle bande Xp11.1-p21, Xq21-qter, 2p12-14 e 4q11-21 (Martin AJ et al, 2002). E’ possibile che, diversamente dal cancro mammario, ove un gene (BRCA1) ha un importantissimo effetto, il substrato genetico della LLC consista nell’intervento di più geni con basso potenziale predisponente (Goldin LR et al, 2007).

 

Patogenesi

 

A cura di: Sara Martinelli (Struttura semplice di Ematologia- Unità operativa di Medicina Interna – Ospedale S. Chiara di Trento).

La patogenesi della LLC riconosce numerosi momenti (Tabella I), incentrati sulle particolarità della cellula d’origine, sulle sue interazioni con ipotetici antigeni e con il microambiente e sullo sviluppo di una vasta gamma di lesioni genetiche.

 

Tabella I: Momenti patogenetici nella LLC

 

 

a) Cellula d’origine

 

Per molto tempo l’espressione del CD5 da parte delle cellule della LLC ha fatto ritenere che la controparte cellulare normale fosse rappresentata dal subset di linfociti B-1 (definito nel topo, senza un chiaro corrispettivo nell’uomo), coinvolto nell’immunità innata e in grado di produrre anticorpi naturali mediante una reazione T-indipendente (Darzentas N et al, 2010). Nell’uomo, l’espressione di CD5 caratterizza le cellule B vergini, mentre viene persa dopo l’incontro con l’antigene. In una parte dei casi di LLC (50-80% nelle varie casistiche) la cellula leucemica presenta >2% di mutazioni somatiche nella sequenza del gene codificante per la porzione variabile delle catene pesanti delle Ig (IGHV), un processo (ipermutazione somatica) che fisiologicamente avviene all’interno del centro germinativo, grazie all’intervento di enzimi quali l’activation-induced cytidine deaminase (AID), in risposta ad antigeni T-dipendenti. La restante parte delle LLC presenta una configurazione “germline” della porzione variabile del gene Ig (i.e. <2% di mutazioni). Il passaggio attraverso il centro germinativo, che quindi caratterizza le LLC “mutate”, è tuttavia incompatibile con la derivazione dai linfociti B-1. Inoltre, lo studio del profilo di espressione genica ha mostrato ampia omogeneità tra i diversi casi di LLC, indipendentemente dallo stato mutazionale dei geni IGHV, ed è risultato somigliante a quello delle cellule B memoria CD27+. I casi di LLC “mutate” potrebbero quindi rappresentare l’espansione di cellule B memoria CD27+ che, in seguito all’incontro con un antigene T-dipendente, hanno attraversato le fasi del centro germinativo; i casi di LLC “non mutate” potrebbero invece derivare da una frazione minoritaria di cellule B CD27+ che hanno incontrato l’antigene in maniera T-indipendente ed hanno sviluppato un fenotipo “memoria” senza passaggio attraverso il centro germinativo (Klein U et al, 2001; Rosenwald A et al, 2001). L’espressione del CD5 potrebbe essere coerente con l’origine delle LLC “mutate” da un subset recentemente riconosciuto di cellule B memoria CD27+ CD5+, mentre per le LLC “non mutate” l’espressione del CD5 sarebbe suggestiva di una origine da cellule B vergini pre-centro germinativo, ipotesi sostenuta anche da alcuni studi di espressione genica (Seifert M et al, 2012), non potendo tuttavia escludere che il fenotipo di superficie possa essere stato alterato dal processo stesso di trasformazione o da uno stato di anomala attivazione e che quindi il CD5 sia comunque espresso da cellule che hanno effettivamente incontrato l’antigene (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
Accanto alle controversie relative all’origine della cellula B matura la cui espansione determina la malattia, recenti evidenze suggeriscono che le più precoci alterazioni genetiche ed epigenetiche che predispongono allo sviluppo della LLC si verifichino a monte, a livello della cellula staminale emopoietica pluripotente (HSCs). Per effetto di queste lesioni precoci, la cui natura non è al momento chiara, il destino di questi progenitori viene orientato verso il lineage B linfocitario, con successiva selezione, per effetto della stimolazione antigenica, di elementi maturi della loro progenie che vanno incontro ad un’espansione prima oligoclonale, quindi monoclonale per accumulo di ulteriori lesioni genetiche (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).

 

b) Ruolo della stimolazione antigenica

 

E’ noto che il clone trasformato nella LLC presenta un utilizzo preferenziale di alcune famiglie V, D e J (ad esempio VH1-69; VH4-34), che non riflette la frequenza di questi riarrangiamenti nella popolazione B-linfocitaria CD5 normale. Poiché queste sequenze, assemblate durante la maturazione B-linfocitaria intramidollare, formano la porzione variabile del gene Ig espressa in superficie come BCR, si può dedurre che alcuni antigeni sono in grado di ingaggiare i cloni esprimenti questi BCR favorendone l’espansione e la successiva trasformazione. Questo concetto è stato rafforzato dalla dimostrazione di “BCR stereotipati”, che presentano una identica sequenza che codifica per la porzione del BCR che lega l’antigene nota come “complementarity determining region” (CDR) (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008; Ghiotto F et al, 2004; Tobin G et al, 2004) . Vista la complessità degli eventi di ricombinazione che portano all’assemblaggio del BCR, la probabilità che due linfociti B normali possano avere casualmente un BCR stereotipato è dell’ordine di 10-12, mentre è stato osservato che fino al 30 % dei casi di LLC può mostrare questo fenomeno (Stamatopoulos K et al, 2007). Tra gli antigeni in grado di ingaggiare il BCR nella LLC si annoverano gli elementi polisaccaridici batterici, il fattore reumatoide, il DNA, la cardiolipina, antigeni espressi sulle cellule apoptotiche (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008). Si è così affermato in questi ultimi anni il concetto di una relazione patogenetica tra stimolazione antigenica, spesso sostenuta da autoantigeni, e LLC17. In effetti è stata fornita una recente elegante dimostrazione di come una proteina, nota come “catena pesante della miosina non-muscolare” (non muscle myosin heavy chain), avente un ruolo nel movimento cellulare, possa essere esposta sulla superficie delle cellule apoptotiche e di come la maggior parte della LLC “non-mutate” possa riconoscere tramite i suoi anticorpi questo antigene (Chu CC et al, 2010).

Esiste inoltre dimostrazione che il linfocito della LLC può mantenere la capacità di rispondere all’antigene a) andando incontro in vivo a switch di classe Ig (Malisan F et al, 1996) b) sviluppando nuove mutazioni del gene IGHV (Gurrieri C et al, 2002), c) esprimendo l’enzima AID (Oppezzo P et al, 2003), importante nel processo di ipermutazione somatica; d) modificando il profilo di espressione genica e attivando il ciclo cellulare (Guarini A et al, 2008). E’ interessante notare che queste caratteristiche sono più spiccate nei casi di LLC “non-mutate” CD38+ e ZAP-70+, rispetto alle altre LLC (Lanham S et al, 2003; Chen L et al, 2002). In effetti, nelle LLC “non-mutate”, il BCR-signaling è attivo, mentre nelle forme “mutate” è inattivo in seguito ad uno stato di anergia funzionale legato ad una protratta stimolazione antigenica, con conseguente desensibilizzazione del BCR stesso (Stevenson FK et al, 2004). Questa condizione di “anergia” si associa ad uno specifico profilo di espressione di geni coinvolti nel signaling BCR-mediato (Muzio M et al, 2008).

Il BCR signaling derivante dalla stimolazione antigenica comporta il coinvolgimento di una serie di molecole che regolano la vita del linfocito neoplastico (Burger JA, 2011). Alcune di queste molecole quali la Bruton tirosin chinasi (BTK) e la subunità delta della fosfatidil-inositol-3 chinasi (PI3K delta), rappresentano bersagli per terapie mirate di dimostrata efficacia (Foà R et al, 2013).

Recentemente è stata inoltre dimostrata la capacità, esclusiva dei BCRs dei linfociti neoplastici in corso di LLC, di attivare la cascata di segnalazione intracellulare indipendentemente da una stimolazione antigenica (Dühren-von Minden M et al, 2012). Questa proprietà sembra essere strettamente dipendente dall’interazione delle regioni HCDR3 dei BCRs dei linfociti leucemici con specifici epitopi intrinseci degli stessi BCRs. Presumibilmente solo alcune sequenze HCDR3 e alcuni specifici epitopi intrinseci hanno questa peculiarità, il che potrebbe giustificare la selezione di un ristretto repertorio di BCRs ed il fenomeno dei recettori stereotipati. Pur non escludendo il probabile contributo di una selezione antigenica specifica, questa ipotesi fornisce una spiegazione alternativa, antigene-indipendente, del fenomeno, ed individua un potenziale nuovo target terapeutico nell’inibizione del signalling autonomo del BCR in pazienti con LLC (Dühren-von Minden M et al, 2012).

 

c) Turn-over cellulare

 

 Contrariamente a quanto ritenuto nel recente passato, la LLC non può essere oggi considerata una patologia da accumulo di linfociti che non vanno incontro ad apoptosi. I linfociti patologici mantengono la sensibilità ad alcuni stimoli pro-apoptotici mediati da Fas e dal legame di anticorpi anti IgM che ingaggiano il BCR (Chu P et al, 2002; Zupo S et al, 2002) e proliferano in vivo ad un ritmo pari allo 0,1-1% dell’intero clone ogni giorno (Messmer BT et al, 2005). Il ritmo di divisione cellulare e di rinnovo è più elevato nella frazione cellulare CD38+ (Calissano C et al, 2009).

 

d) Interazioni con il microambiente

 

Nei linfonodi dei soggetti con LLC esiste un comparto di “accumulo” costituito da piccoli linfociti ed un comparto, quello dei “centri di proliferazione”, ricco in paraimmunoblasti e prolinfociti, ove le cellule mostrano i caratteri dell’attivazione e vanno incontro a divisione cellulare. Queste strutture istologiche, che conferiscono un quadro pseudofollicolare al linfonodo della LLC, si rinvengono anche nei tessuti infiammati dei soggetti affetti da patologia autoimmune (Humby F et al, 2009) e richiamano il concetto del ruolo della stimolazione da parte di autoantigeni nella genesi della LLC. Nei centri di proliferazione i prolinfociti e i paraimmunoblasti sono a stretto contatto con linfociti T CD4 e cellule follicolari dendritiche. Nel comparto di “accumulo” i piccoli linfociti interagiscono con cellule stromali mesenchimali e con cellule “nutrici” (“nurselike cells”) differenziatesi da monociti circolanti, in un contesto di interazioni cellula-cellula che ne favorisce la sopravvivenza. In effetti, la stimolazione da parte del CD40 ha un ruolo nel mantenimento in vita del clone B-linfocitario, al pari dell’interazione con i linfociti T CD4, in grado di determinare la produzione di citochine anti-apoptotiche (IL4, IFN) (Ghia P, Caligaris-Cappio F, 2000). L’importanza in vivo della presenza dei linfociti T CD4 è stata recentemente dimostrata in un modello murino immunodeficiente, in cui il trasferimento di cellule LLC dava origine alla malattia solo in presenza di linfociti T CD4 autologhi (Bagnara D et al, 2011). Le cellule T sono reclutate nel microambiente tumorale da chemochine prodotte dalle cellule leucemiche e ne favoriscono la sopravvivenza tramite interazioni cellulari, in particolare il legame CD40-CD40L. Le cellule leucemiche esprimono inoltre recettori inibitori e producono molecole solubili in grado di rendere inefficace l’attività delle cellule T CD4, CD8 ed NK e sfuggire così alla sorveglianza immunitaria (ten Hacken E, Burger JA, 2014)
Nella distribuzione e sopravvivenza delle cellule patologiche (Stevenson FK, Caligaris-Cappio F, 2004) giocano un ruolo importante a) alcune chemochine e loro recettori, espressi dal linfocito leucemico (CXCR3 e CXCR5), b) cellule del sangue periferico in grado di differenziarsi in cellule “nutrici” (“nurselike”), che favoriscono la sopravvivenza e la migrazione del linfocito all’interno degli spazi midollari attraverso lo stromal-derived growth factor (Burger JA et al,1999), c) le cellule dendritiche, attraverso il CD44 e grazie all’induzione dell’espressione di una proteina BCL2 correlata (Mcl-1) (Pedersen IM et al, 2002). L’angiogenesi può giocare un ruolo nelle fasi di accelerazione della malattia o nei sottogruppi più aggressivi, ove si riscontrano livelli serici più elevati di VEGF (Molica S et al, 2002; Maffei R et al, 2010).

 

e) Lesioni citogenetico-molecolari

 

– geni microRNA e TCL1
Nella LLC non è ad oggi nota la lesione genetica primaria in grado di innescare il processo di trasformazione, ma sono disponibili numerose informazioni su una serie di lesioni che governano il processo di trasformazione (Figura II).

 

Cuneo_leucemia_linfatica_cronica_Figura_2

Figura II. Stimolazione antigenica e lesioni citogenetico-molecolari nella patogenesi della LLC

 

Sono stati localizzati due geni codificanti per microRNA (i.e miR-15 e miR-16) nella regione 13q14, deleta in un 40-50% delle LLC. Questi geni mostrano ridotta espressione in seguito a delezione nella LLC (Calin GA et al, 2002) e, in queste condizioni, può risultare alterata l’espressione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei linfociti B, in particolare il gene antiapoptotico BCL-2. In effetti, la delezione di miR-15 e miR-16 nel topo determina l’insorgenza di un’espansione clonale di linfociti B che presenta le caratteristiche biologiche della LLC. La proliferazione linfoide è più marcata e aggressiva se la delezione coinvolge, oltre ai suddetti geni a microRNA, il gene DLEU2 che mappa nella stessa regione (Klein U et al, 2010). La concomitante delezione di DLEU7, posizionato all’interno della regione di minima delezione, può contribuire alla patogenesi per la perdita/riduzione della sua fisiologica funzione di inibizione di NF-kB (Palamarchuk A et al, 2010).
Nella LLC, inoltre, vi è una consistente overespressione del gene TCL1 che mappa a livello della banda 14q32.1, determinata da un meccanismo di demetilazione del promotore (Yuille MR et al, 2001) e/o da due geni a microRNA, miR-29 and miR-181 (Efanov A et al, 2010). Esiste la documentazione che il topo transgenico per un costrutto che contiene l’enhancer del gene Ig ed il gene TCL1 sviluppa un’espansione clonale B-CD5+, che con il passare del tempo assume le caratteristiche della LLC (Bichi R et al, 2002). Analogamente, il topo transgenico che iperesprime miR-29 nei linfociti B, può sviluppare la LLC (Santanam U et al, 2010). Il ruolo di TCL1 nella patogenesi della LLC è mediato dalla riduzione dell’attività della DNA metiltansferasi 3A con conseguente diminuzione della metilazione del DNA (Palamarchuk A et al, 2012).
La famiglia dei miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) risulta frequentemente ipoespressa nella LLC. Questi geni a miRNA sono target trascrizionali diretti di p53 e sono coinvolti nel pathways dell’apoptosi p53-mediata. Ridotti livelli di miR-34, associati o meno a del17p/ mutazione TP53 o a delezione 11q (ove sono situati i geni che codificano per miR-34b e miR34c) si associano a forme di malattia più aggressiva (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Il profilo di espressione di numerosi altri miRNA (tra i quali miR21, miR181, miR155) riveste un ruolo prognostico nella LLC (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Studi recenti hanno dimostrato come diversi microRNA siano implicati a vario livello anche nella via di segnalazione del BCR e nelle interazioni con il microambiente (Balatti V et al, 2015), con un ruolo di regolazione della proliferazione e apoptosi delle cellule leucemiche che viene attualmente studiato come possibile target terapeutico (Bottoni A et al, 2016).

Mutazioni geniche ricorrenti
Il sequenziamento del genoma di pazienti affetti da LLC (Puente XS et al, 2011; Fabbri G et al, 2011)

ha dimostrato che la LLC si associa a mutazioni di tipo non-silente di numerosi geni, in grado di alterare la funzione delle corrispondenti proteine. Queste mutazioni appaiono più frequenti delle lesioni che comportano perdita o guadagno di materiale genico e sono in genere variabili da paziente a paziente pur potendosi individuare alcuni pathways comunemente coinvolti: regolazione del ciclo cellulare e apoptosi, risposta al danno del DNA, processazione del RNA, vie di segnalazione intracellulare (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). Alcune di queste lesioni sono ricorrenti:

  • Regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno del DNA: oltre alle lesioni di TP53, trattate nel paragrafo 17p-, e di ATM, trattate nel paragrafo 11q-, tra i geni coinvolti nella riparazione/protezione del DNA è risultato mutato in maniera ricorrente POT1, codificante una componente del sistema di mantenimento dei telomeri e mutato in circa il 3% dei pazienti con LLC, tutti appartenenti al sottogruppo con IGHV non mutato (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
  • Vie di segnalazione intracellulare: le lesioni di NOTCH1, presenti nel 10-15% dei casi, comportano l’accumulo di un’isoforma attiva della proteina che è in grado attivare il signalling intracellulare NOTCH1-correlato. I pazienti con questa mutazione presentano in genere una malattia relativamente aggressiva, associata al frequente sviluppo di farmacoresistenza e alla possibile tendenza all’evoluzione in sindrome di Richter . Le mutazioni di NOTCH1 sono più frequenti nei pazienti con IGHV non mutato e con la trisomia 12 (Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012).
  • Oltre alla mutazione del gene stesso, multiple lesioni genetiche ricorrenti in pazienti con LLC sembrano convergere sull’attivazione della via di NOTCH1, in particolare la mutazione inattivante di FBXW7, il cui prodotto interviene nella degradazione della proteina NOTCH1, e una mutazione nella regione non codificante 3’ UTR di NOTCH1 che ne altera lo splicing (Puente XS et al, 2015; Fabbri G et al, 2016). L’effettiva incidenza della deregolazione della via di NOTCH1 nella LLC potrebbe quindi essere sottostimata.
  • Diverse mutazioni ricorrenti nella LLC si traducono invece nell’attivazione del complesso trascrizionale NF-kB. BIRC3 codifica per una proteina che down-regola il signalling di NF-κB e presenta mutazioni inattivanti nel 20% circa delle LLC chemio-refrattarie. La frequenza di queste mutazioni è bassa (<5%) nelle fasi iniziali della malattia (Rossi D et al, 2012). Le lesioni di MYD88, rinvenute nel 5% dei casi e con maggior frequenza nelle LLC con geni IGHVmutati,  comportano la deregolazione di multipli pathways di segnalazione intracellulare con attivazione di target diversi tra cui NF-kB e STAT3 (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). In una piccola frazione di pazienti (1-3%), accomunati da un decorso aggressivo, risulta invece inattivato il gene NFKBIE che codifica un regolatore negativo diretto (IkBe) di NF-kB (Mansouri L et al, 2015).
  • Processazione RNA: Nel 5% delle LLC alla diagnosi si ritrovano mutazioni del gene SF3B1, che codifica per una proteina coinvolta nello splicing del RNA. Le conseguenze della mutazione di SF3B1 nella patogenesi della LLC sono state recentemente studiate con un’analisi trascrittomica che ha dimostrato l’alterazione di meccanismi di riparazione del DNA, di mantenimento delle sequenze telomeriche e, nuovamente, del signalling di NOTCH1 (Wang L et al, 2016). Queste mutazioni sono più frequenti nelle LLC con 11q- (Wang L et al, 2011), si associano ad uno stadio più avanzato, allo stato non mutato dei geni IGHV e alla positività per ZAP70 (Quesada V et al, 2011). Anche questa lesione, al pari delle mutazioni di NOTCH1 si rinviene più frequentemente nelle LLC chemiorefrattarie (Rossi D et al, 2011).

E’ interessante notare come le mutazioni di TP53NOTCH1SF3B1 e BIRC3 siano nella maggior parte dei casi mutualmente esclusive nei casi di LLC refrattari alla fludarabina, per cui è ragionevole ipotizzare che oltre a TP53, le vie del signaling di NOTCH1 ed NF-κB e il sistema dello splicing possano giocare un ruolo indipendente nella genesi della chemiorefrattarietà.

Il progresso delle tecniche di sequenziamento del DNA (next generation sequencing) ne ha consentito l’applicazione su grandi coorti di pazienti (Puente XS et al, 2015; Landau DA et al, 2015). Il sequenziamento dell’intero genoma codificante in 538 casi di LLC (Landau DA et al, 2015) ha individuato mutazioni ricorrenti a carico di due ulteriori pathways con ruolo patogenetico importante: i geni PTPN11 e FUBP1 sono modulatori dell’attività di MYC, mentre le mutazioni di NRAS, KRAS e BRAF implicano il coinvolgimento della via di segnalazione MAPK-ERK. Le lesioni ricorrenti di RPS15, coinvolto nel processo di splicing, e di IKZF3, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dei linfociti B, si sono rivelate mutazioni “driver” precedentemente non note nella patogenesi della malattia (Landau DA et al, 2015). Un dato estremamente interessante è emerso dal sequenziamento su larga scala (506 pazienti) anche delle regioni non codificanti del genoma dei casi di LLC, con l’identificazione di mutazioni ricorrenti in queste sequenze in grado di modificare l’espressione di geni codificanti. Le più rilevanti sono la mutazione ricorrente della regione 3’ UTR di NOTCH1, che ne altera il processo di splicing con delezione del dominio PEST e incremento della stabilità della proteina, e la mutazione a carico di una regione enhancer del cromosoma 9p13, che si associa ad una ridotta espressione del fattore di trascrizione PAX5, essenziale nel differenziamento B-linfocitario (Puente XS et al, 2015).

– Telomeri
I telomeri sono costituiti da sequenze ripetute di DNA che conferiscono stabilità alla struttura dei cromosomi. Con l’invecchiamento della cellula ed in seguito ai cicli replicativi a cui questa va incontro si assiste ad un accorciamento dei telomeri, che viene normalmente limitato dall’attività delle telomerasi. Nella LLC i telomeri dei linfociti patologici sono più corti rispetto ai linfociti B normali di soggetti di pari età e sesso. Inoltre l’accorciamento dei telomeri è più spiccato nelle LLC “non-mutate”, nelle quali si rinviene anche una maggiore attività telomerasica (Damle RN et al, 2004; Grabowski P et al, 2005) e si associa ad una prognosi sfavorevole e ad un’aumentata probabilità di sviluppare la sindrome di Richter (Rossi D et al, 2009). Queste osservazioni indicano come la storia replicativa della LLC sia differente a seconda dello stato mutazionale dei geni Ig e come nei casi più aggressivi vi sia stato uno stimolo proliferativo nelle fasi di emergenza del clone neoplastico in grado di indurre numerosi cicli di attivazione e replicazione con accorciamento, disfunzione e fusione dei telomeri e conseguente insorgenza di esteso danno del genoma (Lin TT et al, 2010).
Un recente lavoro di sequenziamento del genoma in pazienti con LLC familiare ha dimostrato la presenza di mutazioni germline proprio a carico di geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri (in particolare POT1), sottolineando come la disregolazione di questi fini meccanismi di protezione del DNA svolga un ruolo chiave nella patogenesi della LLC (Speedy HE et al, 2016).

 

Anomalie citogenetiche

 

L’introduzione della FISH ha permesso l’individuazione di aberrazioni cromosomiche in circa l’80% dei casi di LLC e ogni paziente viene oggi incluso in uno specifico gruppo in base a una classificazione citogenetica gerarchica che attribuisce importanza decrescente alle seguenti lesioni: 17p- > 11q- > +12 > 13q-. I risultanti gruppi citogenetici hanno una frequenza diversa a seconda dello stadio di malattia, come riportato in Tabella II.

 

Tabella II. Frequenza (% di casi) di aberrazioni cromosomiche alla FISH, di lesioni genetiche e stato mutazionale IGHV in >4000 casi di LLC arruolati nei protocolli del GCLLSG (*)

 

Recentemente, l’introduzione di una stimolazione efficace delle mitosi mediante oligonucleotidi e IL2 ha mostrato che approssimativamente il 30% delle LLC senza difetti cromosomici mediante analisi FISH in interfase può presentare una lesione cromosomica nel cariotipo all’analisi citogenetica e come questi pazienti “FISH normali” con anomalie citogenetiche nel cariotipo abbiano una prognosi sfavorevole (Rigolin GM et al, 2012). Inoltre, è stato dimostrato con questa tecnica che cariotipi complessi potevano essere documentati in una significativa frazione dei casi in associazione con fattori prognostici e quadro clinico sfavorevole (Haferlach C et al, 2007; Rigolin GM et al, 2015). Un quadro riassuntivo del significato delle principali lesioni citogenetiche è presentato in Tabella III.

 

Tabella III: Significato clinicobiologico dei difetti cromosomici ricorrenti nella LLC

 

Nuove sottili aberrazioni sono state identificate mediante sensibilissime tecniche di scansione dell’intero genoma, grazie alla quale sono state documentate lesioni genetiche in virtualmente tutti i casi di LLC (Grubor V et al, 2009).

 

13q-

 

A cura di: Danilo G. Faraci, Antonio Cuneo, Ematologia, Università di Ferrara

La delezione 13q14 è la più frequente anomalia citogenetica nella LLC e viene identificata alla FISH in più del 50% dei casi. Questa delezione è stata descritta come eterozigote in approssimativamente il 75-80% dei casi e omozigote nel restante 20-25%. Studi molecolari hanno dimostrato che la regione comunemente deleta comprende 790 kb tra i marcatori D13S1150 e D13S25.
Pekarsky et al (Pekarsky Y e Croce CM, 2015) hanno individuato tra i geni target della delezione 13q14, un cluster di 30 kb tra gli esoni 2 e 5 del gene DLEU2 codificante per due microRNA (miR-15a/miR-16-1) in grado di regolare la funzione di molteplici oncogeni, principale dei quali risulta essere BCL-2. Tale proteina, nella maggioranza dei casi di LLC, risulta overespressa, facendo intendere pertanto la funzione oncosoppressoria di miR-15a e miR-16-1. La delezione di questi geni per microRNA è stata recentemente confermata da altri ricercatori che hanno utilizzato CGH array ad alta risoluzione in 58 casi di LLC (Buhl AM et al, 2006).
Nel 2010, Klein et al (Klein U et al, 2010) hanno evidenziato che, se nel topo transgenico la delezione è ampia, coinvolgendo sia il cluster miR-15/16-1 che altri loci mappati su DLEU2, anche la malattia assume un decorso più grave, con una proliferazione linfoide più marcata ed aggressiva.
La categoria di pazienti che non presentano altre anomalie cromosomiche associate alla delezione 13q14 è quella a prognosi più favorevole con intervallo tra diagnosi e inizio del trattamento e sopravvivenza superiori rispetto alla LLC con cariotipo normale.
Tuttavia alcune differenze in termini di predittività del decorso clinico sono state osservate in rapporto a, i) delezione eterozigorte o omozigote, ii) grandezza del clone con delezione, iii) ampiezza delle delezione.
Garg R et al, 2012 hanno dimostrato che i pazienti con delezione eterozigote e quelli con delezione omozigote presentano un andamento clinico sovrapponibile. Tale evidenza smentirebbe precedenti ipotesi secondo le quale i pazienti omozigoti potrebbero presentare una maggiore cinetica di crescita linfocitaria rispetto agli eterozigoti.
Individui con un’alta percentuale di cellule con nuclei deleti sembrano avere un decorso più aggressivo della malattia, rientrando a tutti gli effetti nella categoria di rischio citogenetico intermedio (Van Dyke DL et al, 2010).
Dal Bo et al (Dal Bo M et al, 2011) hanno stabilito come cut-off il 70% di nuclei del clone con delezione 13q14, e hanno diviso i casi di LLC del loro studio in quattro sottogruppi: pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1, pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, e pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1. Di questi, solo il primo gruppo manteneva una prognosi favorevole, mentre gli altri tre presentavano un decorso clinico simile alla LLC con cariotipo normale, con diminuzione di TFT e OS. La delezione di oltre il 70% di nuclei delle cellule del clone appare quindi come un marker indipendente di progressione, con impatto maggiore rispetto all’ampiezza della delezione stessa. Tale dato veniva confermato da Van Dyke et al (Van Dyke DL et al, 2016), (dimostrando che i pazienti aventi >85% nuclei 13q- presentano un’evoluzione clinica peggiore, con TFT sovrapponibile a quelli aventi cariotipo normale o trisomia 12.
La minima regione deleta (MDR) del 13q include i loci DLEU2/MIR15A/MIR161, mentre nei casi con ampia delezione il segmento perso può comprendere anche il gene RB1 (banda 13q14.1-q14.2). Xiong et al (Xiong W et al, 2015) hanno dimostrato, mediante l’utilizzo di sonde specifiche per MDR e RB1 alla FISH, che i pazienti aventi un’ampia delezione presentano TFT e OS nettamente più brevi rispetto ai pazienti aventi minima delezione. Tale dato veniva invece contraddetto dai ricercatori canadesi della British Columbia, i quali hanno evidenziato almeno 9 possibili combinazioni di delezione 13q14 a seconda dei geni deleti e della presenza dell’alterazione in entrambi gli alleli o meno. Più comunemente l’ampia delezione risulta monoallelica (55%), fattore che potrebbe spiegare l’impatto non significativo del coinvolgimento del gene RB1 nell’outcome dei pazienti (Huang SJ et al, 2016). Pure Haferlach et al (Haferlach C et al, 2012) hanno dimostrato che l’ampia delezione non influisce negativamente sul TFT. Data la discrepanza dei risultati ottenuti finora dai diversi studi, pertanto il significato prognostico dell’ampiezza della delezione 13q14 risulta poco chiaro e rimane ad oggi un’interessante questione scientifica.
In conclusione, il gruppo di pazienti con 13q- isolata parrebbe essere non omogeneo, in quanto recenti studi hanno messo in evidenza che la percentuale di cellule del clone che presentano nuclei deleti sia in grado di influenzare il decorso e la prognosi della malattia, con la conseguente necessità di ridefinirne il rischio in base a tale parametro. Per quanto riguarda l’ampiezza della delezione stessa, ulteriori studi sono necessari. Risulta evidente che l’implicazione clinica della delezione 13q14 assume quindi un significato più complesso di quanto originariamente attribuitogli.

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