Referto strumentale Beckman Coulter serie LH

Il sistema Coulter LH750 utilizza, per il conteggio e il dimensionamento di leucociti, eritrociti e piastrine, una nuova tecnologia, denominata AccuCount, che integra la misura delle caratteristiche delle cellule con principio impedenziometrico Coulter con nuove tecnologie di indagine e algoritmi software per l’analisi dei volumi cellulari e degli istogrammi di distribuzione. Nella camera di lettura RBC/PLT tutti gli impulsi elettrici con volume compreso tra 36 e 360 fL considerati validi dal sistema “Pulse Edit”, sono classificati come globuli rossi e distribuiti in 256 canali volumetrici con una risoluzione per canale pari a 1,3 fL. Dall’istogramma RBC viene determinato il parametro MCV (Volume Eritrocitario Medio), il parametro RDW (Red Distribution Width, Ampiezza della distribuzione eritrocitaria), che esprime il grado di eterogeneità volumetrica della popolazione RBC, ed è quindi un indice di anisocitosi eritrocitaria.

Tutti gli impulsi che hanno volume compreso tra 2 e 20 fL sono invece classificati come piastrine e distribuiti in 256 canali volumetrici; dall’istogramma relativo vengono ricavati gli indici MPV e PDW. La conta dei leucociti viene effettuata anch’essa con metodo impedenziometrico, dopo lisi eritrocitaria, includendo tutte le particelle con volume superiore a 35 fL, con un controllo accurato delle interferenze ottenuto mediante analisi elettronica degli impulsi. In particolare, viene costruito, per ognuna delle tre aperture di conteggio, l’istogramma volumetrico WBC che riporta in ascissa la scala dei volumi cellulari suddivisa nei 256 canali e in ordinata la frequenza relativa del numero di cellule comprese in ciascun canale volumetrico, distinte nelle tre popolazioni leucocitarie di linfociti, cellule medie e granulociti neutrofili. La determinazione della formula leucocitaria utilizza la tecnologia VCS, che prevede una triplice simultanea misurazione del volume, della conduttività elettrica e dello scatter, o diffrazione luminosa. Ciascuna cellula produce quindi contemporaneamente tre specifici segnali di risposta (laser, DC, RF) che sono analizzati da un circuito elettronico per definire la popolazione cellulare di appartenenza, ovvero distribuzioni cellulari anomale.  Il metodo impedenziometrico classico, che misura l’opposizione prodotta dalle cellule al passaggio di una corrente a bassa frequenza (DC) che fluisce in modo continuo, è utilizzato per determinare il volume cellulare: la variazione di voltaggio prodotta dal passaggio dei leucociti nell’apertura viene registrata dal circuito elettronico sotto forma di impulso, la cui ampiezza è direttamente proporzionale al volume della cellula che lo ha prodotto. La misura della conduttività è ottenuta applicando sulle cellule una corrente ad alta frequenza (RF) di 23 MHz che, “corto-circuitando” la membrana cellulare, consente alla corrente elettrica di attraversare la cellula: il segnale RF che attraversa e oltrepassa la cellula è legato alla sua conduttività, ovvero alla resistenza opposta dal contenuto interno della cellula al passaggio della corrente. La proprietà cellulare analizzata in questo modo è il reciproco della conduttività, ed è definita opacità. Tra gli elementi strutturali interni della cellula, il nucleo è quello con la più bassa resistenza ed è quindi un ottimo conduttore di corrente. Cellule con un elevato rapporto nucleo/citoplasma (linfociti) hanno una opacità minore di cellule con un rapporto nucleo/citoplasma ridotto (granulociti). La presenza di granulazioni all’interno del citoplasma è rilevata infine attraverso le modificazioni che subisce un raggio monocromatico di luce Laser, emesso a 655 nm da un laser Elio-Neon, che colpisce le cellule contemporaneamente alla misura di Impedenziometria e di opacità. Un rilevatore multiangolo posto a 10° – 70° consente di valutare la luce diffratta dalle cellule, direttamente proporzionale alla loro granularità, alla riflettanza e alla struttura della membrana cellulare.
La misura dello scatter di luce laser, combinata alle misure di impedenza e conduttività/opacità, consente una classificazione completa delle popolazioni leucocitarie in base alle peculiari caratteristiche morfologiche: volume cellulare, grandezza e densità del nucleo, rapporto nucleo/citoplasma, granularità e superficie cellulare.
Questi sistemi forniscono inoltre per tutti i campioni analizzati ulteriori 24 parametri posizionali delle principali popolazioni leucocitarie e dei reticolociti. Per ciascuna popolazione viene fornito il valore medio (MEAN) e il grado di eterogeneità (SD) delle misure di volume cellulare, opacità/conduttività, che esprime la densità nucleare e il rapporto nucleo/citoplasma, e scatter di luce laser (S), che misura la granularità interna e la superficie cellulare. Questi parametri posizionali o CPD (Cell Population Data) consentono una valutazione oggettiva, numerica, delle caratteristiche morfologiche delle popolazioni cellulari e del loro posizionamento nei grafici di distribuzione tridimensionali. L’analisi con metodo VCS è utilizzata anche per l’analisi dei reticolociti e degli eritroblasti. I reticolociti vengono contati dopo colorazione automatica con nuovo blu di metilene. Oltre al conteggio totale, vengono ricavati la frazione reticolocitaria immatura (IRF) e il volume medio dei reticolociti (MRV). Un complesso algoritmo fornisce la  conta degli eritroblasti su tutti i campioni per i quali viene misurata la formula leucocitaria.