Disordini da difetto di epcidina – Clara Camaschella
26 ottobre 2011
Referto strumentale Beckman Coulter serie LH
11 dicembre 2011

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Il principo di funzionamento dei sistemi Cell Dyn è duplice: elettrico e ottico. Essi contano le cellule con il metodo impedenziometrico e classificano i leucociti grazie alla misurazione della diffusione di luce laser a tre diversi angoli (0° proporzionale alla grandezza, 10° proporzionale alla struttura, 90° proporzionale alla granulosità); gli eosinofili sono classificati separatamente grazie alla specifica proprietà delle loro granulazioni di depolarizzare la luce polarizzata. Il  sistema Cell Dyn 4000 è stato il primo a utilizzare, nel campo dell’analisi ematologica automatizzata, un laser ad argon con caratteristiche analoghe a quelle dei citofluorimetri non dedicati, che reso possibili nuove applicazioni, come la conta diretta dei reticolociti in fluorescenza, il conteggio assoluto degli eritroblasti e la misura della vitalità cellulare. Per la conta eritrocitaria, gli eritrociti vengono sottoposti ad un processo di sfericizzazione  per minimizzare l’impatto delle variazioni di forma e di viscosità cellulare sulle misurazioni del MCV. L’analisi dei reticolociti prevede l’impiego di un nuovo colorante fluorescente (CD4K530) che conferisce una colorazione brillante all’acido nucleico (RNA e DNA) che permette di separare chiaramente i reticolociti sia dalle emazie che dalle cellule nucleate contenenti DNA e di valutare la maturità dei reticolociti in base alla loro concentrazione di RNA. Dopo essere stata  colorata, l’aliquota dei reticolociti viene fatta passare attraverso la cella di flusso e vengono eseguite le misurazioni dello scatter ad angolo intermedio (7°) e della fluorescenza verde (FL1, 530 nm). Le piastrine vengono escluse poiché il loro scatter sui 7° è minore.  Le cellule nucleate (leucociti ed eritroblasti) vengono escluse a causa della  maggiore fluorescenza data dal loro contenuto di DNA. Per l’analisi delle piastrine viene fornita una conta ad impedenza (PLTi) e una ottica bidimensionale (PLTo), ottenuta tramite la rilevazione dello scatter luminoso bidimensionale (90° e 7°). La conta ad impedenza svolge la funzione di controllo di qualità della conta principale e viene fornita solo  quando si verifica una differenza significativa tra le due conte. E’ anche possibile l’esecuzione di una conta immunologica delle piastrine (con anticorpi monoclonali specifici anti-CD61), utile per campioni di difficile definizione e di importanza clinica che presentano interferenze dimostrate o sospette nella conta piastrinica.

L’analisi dei leucociti è basata sul metodo ottico: nel canale di conteggio il segmento di campione viene diluito, emolizzato e colorato con un fluorocromo specifico per il DNA, lo ioduro di propidio (PI),  che emette una fluorescenza rossa quando viene colpito dalla luce laser. In seguito alla lisi delle membrane cellulari i nuclei degli eritroblasti vengono rapidamente colorati dal PI, che si lega anche alle inclusioni degli eritrociti contenenti acido nucleico, come i corpi di Howell-Jolly ed i parassiti della malaria. Il PI penetra selettivamente nei leucociti a seconda dell’ integrità delle loro membrane: esso colora rapidamente il DNA del nucleo delle cellule che hanno membrane permeabili (danneggiate o non-vitali), ma non quello delle cellule intatte. Nella cella di flusso i leucociti colorati vengono sottoposti a una complessa analisi della diffrazione ottica a tre angoli di rilevazione, alla misura della fluorescenza e dello scatter di luce depolarizzata. Gli eosinofili vengono separati dai neutrofili sulla base della loro maggiore capacità di modificare il piano di polarizzazione del raggio laser (“depolarizzazione”). I citogrammi della conta differenziale completa sono costruiti utilizzando solo due dimensioni (assi x-y) per volta.  Un colore differente viene impiegato per classificare specificatamente ciascun evento cellulare.  La fluorescenza rossa (FL3) emessa in seguito alla colorazione con PI viene usata per identificare gli eritroblasti, utilizzando tre parametri:  la perdita di luminosità assiale (0°), lo scatter ad angolo intermedio (7°) e la fluorescenza rossa (FL3). In base a tali proprietà gli NRBC vengono separati sia dai leucociti vitali che da quelli non-vitali, formando un “cluster” di discrete dimensioni che permette il conteggio sia del numero assoluto che del numero per ogni 100 leucociti. Le rimanenti cellule ad alta fluorescenza vengono classificate come leucociti non-vitali ed il loro numero è espresso sotto forma di frazione di vitalità leucocitaria (WVF) rispetto al totale dei globuli bianchi.
Sulla base di un esame multidimensionale ponderato della quantità e del grado di variazione di posizione, e della dispersione rispetto alle popolazioni cellulari mature normali, vengono individuati i blasti, i granulociti immaturi, le cellule “a banda” e i linfociti atipici. Infine è possibile avere in automazione un conteggio dei linfociti CD4 e CD8 positivi, unitamente al rapporto CD4/CD8, utile per una discriminazione diagnostica immediata dei campioni con alterazioni linfocitarie.

 

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