Nuovi parametri strumentali
Per la serie eritroide con i parametri strumentali attualmente disponibili, sulla base dell’esame emocromocitometrico, è possibile attivare uno screening per la diagnostica differenziale delle anemie sia su base volumetrica (valutazione del parametro MCV) che su base rigenerativa (valutazione della frazione immatura dei reticolociti presente nel sangue periferico) (Figure 1-4).
Figura 1. Referti strumentali ADVIA 2121 e Sysmex2100 del sangue periferico di un paziente con grave anemia normocitica associata a reticolocitosi con aumento della frazione reticolocitaria immatura (IRF).
Figura 2. Referti strumentali CELLDYN 4000 e LH750 del sangue periferico di un paziente con grave anemia normocitica associata a marcata riduzione della frazione reticolocitaria immatura (IRF).
Figura 3. Quattro differenti referti strumentali del sangue periferico di pazienti con grave anemia macrocitica/megaloblastica.
Figura 4. Quattro differenti referti strumentali del sangue periferico di pazienti con anemia microcitica.
Nell’ambito della diagnostica differenziale delle anemie microcitiche la disponibilità nelle differenti tecnologie di parametri come il rapporto M/H (% emazie microciti che/% di emazie ipocromiche) (Figure 5-6), MAF (Fattore anemia microcitica), RBC-y (emazie ipocromiche), LHD (Densità emoglobina bassa), CHr e RetHE (Concentrazione emoglobinica reticolocitaria), consente uno screening tra le anemie microcitiche ferro-carenziali e la talassemia minor (Figura 7).
Figura 5. L’analisi combinata sulla stessa popolazione eritroide delle curve di distribuzione dei volumi (RDW) e del contenuto in Hb (HDW) consente di identificare le percentuali circolanti di globuli rossi macrocitici, microcitici, ipocromici e ipercomici, utilizzando la tecnologia Siemens.
Figura 6. Un rapporto MICRO/HYPO (%emazie microcitiche/% di emazie ipocromiche) >1 o < 1 è suggestivo per la presenza, rispettivamente, di una popolazione microcitica da trait talassemico, ovvero da carenza marziale: questo parametro è disponibile sui sistemi ADVIA.
Figura 7. La presenza di un ridotto contenuto di ferro nella popolazione dei reticolociti è il primo indicatore di una emopoiesi da carenza marziale sia reale che funzionale.
Nell’ambito delle anemie emolitiche da alterazione della membrana eritrocitaria abbiamo a disposizione parametri come %Hyper (la percentuale di emazie ipercromiche) e MCVr (MCV rilevato nel canale di analisi dei reticolociti) utili per l’identificazione di sferociti. La presenza di una doppia popolazione eritrocitaria (popolazione dimorfica) viene facilmente evidenziata dall’osservazione dell’isogramma di distribuzione dei volumi eritrocitari. Di grande rilevanza ai fini di uno screening immediato è la possibilità di avere in automazione la segnalazione e/o il conteggio sia di eritroblasti in circolo (Figura 8), che di frammenti di globuli rossi (Figura 9): in entrambi i casi, è necessaria, in caso di prima osservazione, una validazione qualitativa del dato al microscopio.
Figura 8. Il conteggio degli eritroblasti nel SP è oggi incluso nei parametri forniti dagli analizzatori.
Figura 9. Il conteggio in automazione dei frammenti di GR nel SP è oggi disponibile con due diverse tecnologie, Siemens e Sysmex.
Nell’analisi strumentale quantitativa delle piastrine è molto importante l’identificazione di artefatti che possono causare pseudopiastrinopenie o pseudotrombocitosi, situazioni che determinano sul referto la presenza di allarmi specifici e/o anomalie della distribuzione dei volumi piastrinici negli istogrammi, facendo particolare attenzione alle situazioni di mancata separazione dal rumore di fondo ovvero dalla popolazione eritrocitaria (Figura 10). Il valore della dimensione delle piastrine (MPV) e il parametro IPF (frazione immatura delle piastrine) sono parametri molto utili per segnalare la presenza in circolo piastrine di grandi dimensioni, siano esse piastrine giganti ovvero piastrine immature e/o reticolate. Tutti i sistemi eseguono una doppia conta delle piastrine per fornire un valore accurato e preciso, molto utile nei casi di piastrinopenia vera. Il sistema CELL DYN Sapphire è in grado di fornire il conteggio delle piastrine utilizzando tre differenti metodi: ottico, impedenziometrico e citofluorimetrico utilizzando come marcatore il CD61 (Figura 11).
Figura 10. In presenza di aggregati piastrinici tutti le tecnologie forniscono un allarme accurato e preciso, che indirizza immediatamente alla revisione microscopica del campione di sangue periferico.
Figura 11. La tecnologia Abbott (CELL DYN Sapphire) è in grado di fornire il conteggio delle piastrine utilizzando tre differenti canali: ottico (PLTo), impedenziometrico (PLTi) e citofluorimetrico, utilizzando l’anticorpo monoclonale CD61 (CD61).
Per quanto riguarda i globuli bianchi, gli strumenti automatici sono in grado di contare e classificare i leucociti normali presenti nel sangue periferico con buona precisione e accuratezza, sia negli intervalli di riferimento, sia in presenza di anomalie distributive a carico di una o più categorie. In questo primo compito le macchine si sostituiscono all’uomo nella gestione di quella parte dell’attività analitica costituita dalla valutazione quantitativa. Gli strumenti ematologici automatici sono considerevolmente più precisi rispetto al metodo microscopico, grazie al numero elevato, pari a diverse migliaia, di cellule che vengono analizzate in sospensione, senza irregolarità distributive, mediante misurazioni obiettive e standardizzate. Questa migliorata precisione trova importanti applicazioni soprattutto in presenza di gradi spiccati di leucopenia, con vantaggi immediati nel controllo longitudinale ematologico dei pazienti sottoposti a terapie mieloablative. Con gli strumenti odierni abbiamo avuto modo di migliorare in misura significativa e con implicazioni cliniche immediate l’aspetto più debole della formula leucocitaria tradizionale, quello quantitativo, rendendo possibile la gestione in automazione di campioni altamente citopenici, ma qualitativamente normali, grazie alla grande precisione delle conte assolute di singole classi cellulari. Anche in presenza di alterazioni quantitative di una o più popolazioni leucocitarie con normale morfologia, la gestione in automazione consente una refertazione accurata e precisa. L’accuratezza analitica degli strumenti più evoluti è molto elevata per neutrofili, linfociti ed eosinofili; le maggiori discrepanze riguardano il conteggio dei monociti, fortemente dipendente dalla metodologia analitica, e quello dei basofili, a causa della frequenza molto bassa di questa classe di leucociti. Un aspetto fondamentale della formula leucocitaria eseguita in automazione è rappresentato dalla segnalazione di cellule atipiche e/o immature, consentendo di identificare e selezionare, attraverso segnali specifici, quei campioni che richiedono una revisione microscopica. Nelle Figure 12-15 sono riportati quattro referti strumentali di leucemie acute analizzate con differenti tecnologie: in tutti i casi sono evidenti le segnalazioni strumentali per presenza di cellule immature e/o blasti.
Figura 12. Referto XE-2100 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta mieloide: nella zona degli allarmi (Flags) compaiono le segnalazioni per cellule immature e o atipiche.
Figura 13. Referto ADVIA2120 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta a promielociti: nella zona degli allarmi (allarmi morfologici) compaiono le segnalazioni +++ per blasti e per granulociti immaturi. Il conteggio strumentale dei blasti è di 30.9%, valore confermato alla revisione al microscopio.
Figura 14. Referto CELL DYN 4000 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta monoblastica: sono chiaramente evidenti le segnalazioni per presenza di blasti e di granulociti immaturi (IG).
Figura 15. Referto LH750 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta linfoblastica: sono chiaramente evidenti in rosso le segnalazioni per presenza di linfoblasti e di linfociti varianti.
Le popolazioni cellulari atipiche vengono caratterizzate in modo alternativo e complementare rispetto alla morfologia e alla citochimica convenzionali: fondamentali a questo proposito sono le distribuzioni grafiche monodimensionali (istogrammi) o bidimensionali (citogrammi) con cui gli strumenti rappresentano le distribuzioni delle diverse classi cellulari separate in funzione delle specifiche proprietà che ciascuna metodologia analizza. Inoltre, per alcune categorie cellulari, come quella dei precursori della serie granulocitica e/o quella dei blasti, sono stati sviluppate da alcune tecnologie metodiche per la determinazione quantitative di queste cellule, quando presenti nel campione di sangue periferico. Anche nell’analisi strumentale dei leucociti, è fondamentale individuare quei campioni con pseudoleucocitosi, artefatto in genere causato dalla presenza di particelle di dimensioni tali da entrare nell’intervallo volumetrico del conteggio leucocitario, o con pseudoleucopenia, artefatto in cui la conta leucocitaria è falsamente diminuita per sottrazione di una quota dei leucociti circolanti al conteggio, in genere per agglutinazione leucocitaria e/o leucopiastrinica. Si segnala infine la possibilità di avere oggi anche le percentuali delle sottopopolazioni linfocitarie circolanti (CD3, CD4 e CD8) e il rapporto CD4/CD8 nel referto di sangue periferico, utilizzando la tecnologia Abbott (Figura 16).
Figura 16. Referto CELL DYN Sapphire di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta monoblastica: sono chiaramente evidenti le segnalazioni per presenza di blasti e di granulociti immaturi (IG).
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A cura di:
Professore Associato in Ematologia, Università Cattolica del Sacro Cuore. Direttore UOC Emotrasfusione, Direttore Banca Cordone Ombelicale UNICATT, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS – Roma
Gina Zini
Professore Associato in Ematologia, Università Cattolica del Sacro Cuore. Direttore UOC Emotrasfusione, Direttore Banca Cordone Ombelicale UNICATT, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS – Roma