Il panorama genetico della leucemia acuta linfoide (LAL) è stato ridefinito negli ultimi anni grazie all’impiego di metodiche di microarray e di sequenziamento di nuova generazione che consentono di studiare simultaneamente numerosi geni – e persino l’intero genoma – e di identificare aberrazioni presenti anche in piccoli cloni tumorali. Tali progressi hanno portato all’identificazione di nuove alterazioni e hanno consentito di meglio definire il processo di leucemogenesi spesso associato ad una alterazione primaria macroscopica, generalmente costituita da una traslocazione, alla quale si possono aggiungere lesioni secondarie cooperanti, comunemente rappresentate da mutazioni puntiformi e alterazioni del numero di copie, ossia delezioni e amplificazioni (Moorman AV, 2016). Infatti, sia nei sottogruppi caratterizzati dalle più frequenti macroalterazioni (i.e. ETV6-RUNX1, BCR-ABL1, riarrangiamenti di KMT2A, TCF3-PBX1, iperdiploidia) che in quelli “orfani” di una aberrazione genetica sono state identificate nuove micro-alterazioni (Figura I).
Figura I: Schema delle alterazioni genetiche che contribuiscono alla leucemogenesi nei diversi sottogruppi di LAL-B (adattata da Moorman AV, 2016).
Queste acquisizioni hanno anche importanti implicazioni cliniche: infatti, il riconoscimento di alterazioni che possono essere inibite da farmaci specifici può consentire di ampliare le scelte terapeutiche.
Questo approfondimento tratterà le nuove acquisizioni nella genetica della LAL-B.
LAL-B
Nell’ambito della LAL-B le ricerche sono state principalmente focalizzate sulle LAL-B prive dei riarrangiamenti studiati nella routine diagnostica (i.e. ETV6-RUNX1, BCR-ABL1, riarrangiamenti di KMT2A, TCF3-PBX1). Questa ricerca ha portato all’identificazione di nuove alterazioni e quindi nuovi sottogruppi molecolari di particolare interesse. Il sottogruppo dei BCR-ABL1-like, e le alterazioni molecolari che lo caratterizzano, è quello che ha attratto maggiormente l’attenzione e ad esso è già stato dedicato unapprofondimento ; le caratteristiche biologiche e cliniche degli altri sottogruppi sono trattate di seguito.
LAL con iAMP21
L’amplificazione intracromosomica del cromosoma 21 (iAMP21) si riscontra in circa il 2% delle LAL-B ed è più frequente nei bambini più grandi e negli adolescenti (Moorman AV et al, 2013; Harrison CJ et al, 2014). iAMP21 è caratterizzata dal guadagno di almeno 3 copie di una regione di dimensione variabile del cromosoma 21; tutti i casi sono accomunati dagli elevati livelli di amplificazione di una regione di 5.1 Mb da 32.8 a 37.9 Mb, che contiene RUNX1, e dalla concomitante delezione subtelomerica del cromosoma 21 (Figura II).
Figura II: Rappresentazione del profilo di copy number di una tipica iAMP21. Un numero di copie inferiore a 2 indica una delezione mentre un numero superiore a 2 indica un’amplificazione. La barra rossa indica la regione di amplificazione comune di 5.2 Mb (adattata da Harrison CJ et al, 2018).
Tale alterazione è stata associata a prognosi infausta. Tuttavia, la prognosi è migliore se i pazienti con iAMP21 vengono considerati ad alto rischio e trattati di conseguenza (Moorman AV et al, 2013). Lo studio dell’impatto della malattia minima residua (MMR) ha prodotto risultati contrastanti: il gruppo BFM (Berlin-Frankfurt-Munster) ha riportato che i pazienti con iAMP21 con MMR positiva avevano una prognosi peggiore rispetto a quelli con MMR negativa (Attarbaschi A et al, 2008), mentre i risultati del COG (Children’s Oncology Group) suggeriscono che la MMR non rappresenta un fattore prognostico rilevante in questo sottogruppo di pazienti (Heerema NA et al, 2013).
Le lesioni genetiche associate a iAMP21 includono delezioni di IKZF1, CDKN2A, PAX5, ETV6, RB1, guadagni del cromosoma X ed il riarrangiamento P2RY8-CRLF2 (Rand V et al, 2011). Inoltre, i casi con la traslocazione robertsoniana tra i cromosomi 15 e 21, rob(15;21)(q10;q10)c, hanno un rischio di circa 2700 volte superiore di sviluppare una LAL iAMP21 rispetto alla popolazione generale. Questa osservazione è servita a chiarire l’affascinante meccanismo alla base della formazione della iAMP21 (Li Y et al, 2014). Infatti, si suppone che la rob(15;21)c predisponga le cellule alla cromotripsi – un processo “catastrofico” in cui molte regioni cromosomiche vengono frammentate e riarrangiate – e che questa generi la iAMP21 associata a rob(15;21). Nella iAMP21 sporadica, invece, si ipotizza che l’evento scatenante sia il meccanismo di “breakage-fusion-bridge” che determina la formazione di un cromosoma 21 dicentrico. Quest’ultimo è soggetto a cromotripsi o altri riarrangiamenti come la iAMP21.
LAL con deregolazione di DUX4 ed ERG
Circa il 7% delle LAL-B pediatriche ed adulte presenta un immunofenotipo ed un profilo di espressione genica distintivo dovuto alla presenza di riarrangiamenti di DUX4, un fattore di trascrizione homeobox localizzato nella regione subtelomerica D4Z4 nel 4q e 10q (Lilljebjorn H et al, 2016; Yasuda T et al, 2016; Zhang J et al, 2016). Nella maggioranza dei casi, almeno una copia tronca di DUX4 è inserita nel locus IGH, più raramente in una regione intragenica di ERG. Sia IGH-DUX4 che ERG-DUX4 determinano l’espressione di un’isoforma tronca al 3’ di DUX4 con l’aggiunta di nucleotidi di regioni non codificanti di IGH o ERG, portando alla formazione di una proteina DUX4 con il C-terminale sostituito da 0-50 nucleotidi della regione non codificante del gene partner.
DUX4 non è espresso dalle cellule B normali ed il meccanismo mediante il quale possa essere indotta la leucemogenesi non è ancora chiaro. Zhang e colleghi hanno dimostrato che i campioni con riarrangiamenti di DUX4 sono caratterizzati dall’espressione di isoforme aberranti di ERG. La produzione dell’isoforma più abbondante si deve al legame di DUX4 ad un promotore criptico di ERG localizzato nell’introne 6 che induce l’espressione di un trascritto alternativo di ERG, denominato ERGalt. ERGalt inibisce l’attività di ERG wild-type ed è quindi ritenuto importante per la trasformazione leucemica (Figura III).
Figura III: Meccanismo di leucemogenesi mediato dalla deregolazione di DUX4 e ERG. I riarrangiamenti di DUX4 determinano iperespressione di DUX4. DUX4 lega un sito di inizio trascrizione alternativo di ERG e l’espressione di una nuova isoforma ERGalt. ERGalt inibisce l’attività trascrizione di ERG WT e quindi risulta leucemogeno. ERG è anche bersaglio di delezioni ad opera delle proteine RAG (adattata da Iacobucci I e Mullighan CG, 2017).
Le altre isoforme derivano dalle delezioni degli esoni 3-7 o 3-9 ad opera delle proteine RAG.
La prognosi dei pazienti con riarrangiamenti di DUX4 è favorevole, nonostante la presenza di alterazioni concomitanti. Infatti, oltre alle delezioni di ERG, comunemente documentate nei casi con riarrangiamenti di DUX4, altre alterazioni frequenti sono rappresentate da delezioni di CDKN2A/2B, IKZF1, PAX5, mutazioni attivanti di K/NRAS e dei fattori di trascrizione MYC, MYCBP2, MGA e ZEB2 (Zhang J et al, 2016).
LAL con riarrangiamenti di ZNF384
Sebbene la presenza di geni di fusione di ZNF384 sia nota fin dal 2002, soltanto di recente è stato riconosciuto che 1-6% dei casi di LAL pediatriche e il 5-15% delle LAL dell’adulto presentano fusioni di ZNF384 con almeno 9 partner diversi: ARID1B, BMP2K, CREBBP, EP300, EWSR1, SMARCA2, SYNRG, TAF15 e TCF3 (Lilljebjorn H et al 2016; Shago M et al, 2016; Yasuda T et al; 2016; Hirabayashi S et al, 2017; Qian M et al, 2017). Indipendentemente dal gene partner, i casi con riarrangiamento di ZNF384 (r-ZNF384) sono caratterizzati da un profilo trascrizionale distintivo e da un immunofenotipo peculiare dovuto alla bassa espressione del CD10 ed all’espressione degli antigeni mieloidi CD13 e/o CD33 (Hirabayashi S et al, 2017). I casi con r-ZNF384 presentano una media di 4.3 mutazioni che si riscontrano prevalentemente nei geni che regolano l’epigenetica come CREBBP, EP300, KDM6A, CHD4, CHD8, alterati nell’82% dei casi (Qian M et al, 2017). Analogamente ad altri sottogruppi, anche in questo sono frequenti le mutazioni dell’asse RAS-PI3K come quelle di KRAS, NRAS, PTPN11 e PIK3CD.
Data la molteplicità di geni partner, è possibile che il meccanismo responsabile della leucemogenesi in questi casi non sia unico e che le proteine di fusione conferiscano nuove proprietà capaci di interferire con l’emopoiesi fisiologica a vari livelli. Studi preliminari di Qian e colleghi (2017) hanno dimostrato che i casi con r-ZNF384 presentano un profilo di espressione genica distintivo e tra i geni più significativamente iperespressi menzionano CLCF1 e BTLA, quest’ultimo importante per il differenziamento delle cellule B e direttamente legato alla cascata del BCR (B-cell receptor). Ciononostante, gli studi funzionali focalizzati sui riarrangiamenti formati da ZNF384 con le acetiltransferasi hanno dimostrato che queste proteine di fusione non sono in grado di trasformare le cellule Ba/F3 in vitro, suggerendo che non hanno capacità trasformanti da sole ma che potrebbero incrementare il potenziale oncogenico di altre lesioni. Gli stessi autori hanno inoltre dimostrato che le proteine di fusione CREBBP-ZNF384 e EP300-ZNF384 determinano una perdita dell’attività istone-acetiltransferasica (Qian M et al, 2017). Pertanto, i pazienti con LAL r-ZNF384 potrebbe giovarsi di trattamenti basati su farmaci che agiscono sulla regolazione dell’acetilazione istonica.
Dal punto di vista clinico, studi su esigue coorti di pazienti hanno suggerito che i pazienti con r-ZNF384 presentano una prognosi favorevole/intermedia, ma sono necessari ulteriori studi per definire meglio l’impatto prognostico di questa lesione (Liu YF et al, 2016; Hirabayashi S et al, 2017).
LAL con riarrangiamenti di MEF2D
I riarrangiamenti di MEF2D (r-MEF2D) si riscontrano nel 1-4% delle LAL-B pediatriche e nel 7% delle LAL-B dell’adulto e sono associati a prognosi infausta.
MEF2D forma geni di fusione con almeno 6 geni partner: BCL9, CSF1R, DAZAP1, FOXJ2, HNRNPUL1 e SS18 (Lilljeborn H et al, 2014; Roberts KG et al, 2014; Gu Z et al, 2016). Il più frequente è MEF2D-BCL9, del quale sono state identificate 4 isoforme.
In tutte le proteine di fusione, MEF2D conserva il dominio MADS-box, che media il legame al DNA, ed il gene partner lo stabilizza e ne determina una aumentata attività trascrizionale. Tali fusioni presentano capacità leucemogena sia in vitro che in modelli murini. Ad eccezione di MEF2D/CSF1R, documentato nelle LAL BCR/ABL1-like, i casi con r-MEF2D presentano un profilo trascrizionale caratterizzato da deregolazione dei geni controllati da MEF2D. Tra questi, è importante ricordare HDAC9, che risulta iperespresso: tale alterazione potrebbe spiegare la sensibilità di cellule di LAL r-MEF2D derivanti da xenograft agli inibitori delle HDAC (Gu Z et al, 2016). Data la prognosi infausta di questi pazienti diventa quindi importante sperimentare nuovi approcci che inibiscano le vie di segnalazione deregolate.
Lesioni concomitanti sono rappresentate dalle delezioni di IKZF1 e dalle mutazioni dei membri della cascata di RAS (Gu Z et al, 2016).
Altri riarrangiamenti e casi non classificati
Altre alterazioni frequenti sono le traslocazioni di IGH con CRLF2 e EPOR – nella LAL BCR/ABL1-like – e con membri della famiglia CEBP e ID4. Tali alterazioni si riscontrano in <3% dei bambini e nel 10% circa degli adolescenti/adulti affetti da LAL-B e sono associate a prognosi infausta, come riportato da Russel et al, 2014.
Le fusioni di PAX5 con vari geni partner caratterizzano circa il 2% delle LAL-B e prevalgono nei casi con cromosomi dicentrici che coinvolgono il 9p, cioè dic(7;9), dic(9;12) e dic(9;20) (An Q et al, 2008). Il riarrangiamento determina la fusione del dominio di legame al DNA al 5’ N-terminale di PAX5 al 3’ C-terminale del gene partner, con conseguente perdita del dominio di transattivazione di PAX5. Molte di queste fusioni inibiscono la normale attività trascrizionale di PAX5: tuttavia, non è ancora chiaro se queste lesioni abbiano un effetto oncogenico e quale sia il meccanismo con cui possano promuovere la leucemogenesi. Inoltre, i cromosomi dicentrici sopramenzionati si riscontrano spesso in concomitanza con BCR/ABL1 e ETV6/RUNX1, e quindi probabilmente non rappresentano delle lesioni primarie.
Ancor più raro è il gene di fusione TCF3-HLF che deriva dalla t(17;19)(q22;p13), si riscontra in <1% delle LAL-B pediatriche ed è associato a recidiva di malattia e prognosi infausta. Questo sottotipo di LAL-B è associato a delezioni intrageniche di PAX5, VPREB1 e BTG1, nonché da mutazioni di membri della cascata di RAS e dell’allele TCF3 non riarrangiato che potrebbero contribuire alla LAL TCF3-HLF-positiva. Il programma trascrizionale delle LAL TCF3-HLF differisce sostanzialmente dalla LAL TCF3-PBX1, più frequente e più nota, e ha caratteristiche staminali e mieloidi. Lo studio del profilo di sensibilità ai farmaci ha rivelato una elevata sensibilità al venetoclax, inibitore di BCL2, che potrebbe quindi rappresentare una valida alternativa terapeutica per questi raro sottogruppo di pazienti (Fischer U et al, 2015).
La Figura IV schematizza le alterazioni genetiche che contribuiscono alla leucemogenesi nei nuovi sottogruppi di LAL-B.
Figura IV: Schema delle alterazioni genetiche che contribuiscono alla leucemogenesi nei nuovi sottogruppi di LAL-B.
L’incidenza e la distribuzione dei sottogruppi descritti è riassunta in Figura V. Come si deduce dalla figura, sebbene il panorama genetico della LAL-B si sia arricchito enormemente di nuovi sottogruppi, rimangono ancora parecchi casi non classificati che nelle casistiche pediatriche rappresentano circa il 10% dei casi e nell’adulto una porzione più elevata.
Figura V: Distribuzione e incidenza dei sottogruppi di LAL-B nelle fasce d’età (adattata da Iacobucci I e Mullighan CG, 2017).
Alterazioni geniche associate alla recidiva e meccanismi di evoluzione clonale
La recidiva è associata a prognosi particolarmente infausta ed è quindi di particolare interesse cercare di stabilire quali siano gli eventi genetici che la determinano.
Le mutazioni del gene CREBBP, che codifica per un coattivatore trascrizionale, si riscontrano nel 20% dei casi pediatrici recidivati ed è stato dimostrato che inficiano la risposta alla terapia con glucocorticoidi (Mullighan CG et al, 2011). Altrettanto frequenti sono le mutazioni di NT5C2 riscontrate nel 19% di LAL-T e il 3% di LAL-B alla recidiva e conferiscono resistenza aumentata agli analoghi delle purine (Meyer JA et al, 2013; Tzoneva G et al, 2013). Altre mutazioni frequenti alla recidiva sono le delezioni del gene coinvolto nella riparazione dei mismatch del DNA MSH6, del recettore di glucocorticoidi NR3C1, della H3K36 trimetiltransferasi SETD2, della demetilasi lisina-specifica KDM6 e del regolatore epigenetico MLL2 (Mullighan CG et al, 2008; Ma X et al, 2015).
A queste mutazioni si aggiungono quelle dei geni della via di RAS (KRAS, NRAS, FLT3, PTPN11) che sebbene abbiano una frequenza simile alla diagnosi e alla recidiva presentano un andamento peculiare in quanto subiscono sia una pressione positiva che negativa in seguito al trattamento: infatti, alcune sono selezionate dalla terapia e la loro VAF (variant allele frequency) incrementa, mentre altre vengono perse (Oshima K et al, 2016). Oltre ad essere associate a prognosi sfavorevole, le mutazioni attivanti dei membri della cascata di RAS rendono le cellule leucemiche sensibili agli inibitori di PI3K/mTOR e MEK, e potrebbero rappresentare quindi un importante bersaglio terapeutico (Irving J et al, 2014; Messina M et al, 2016).
Sebbene siano pochi gli studi che hanno esaminato l’evoluzione clonale delle cellule di LAL alla recidiva, sono emersi due meccanismi principali, come dimostrato da Ma et al, 2015: 1) nel 75% dei casi il clone della recidiva deriva da un subclone già presente alla diagnosi; 2) nel 25% dei casi, invece, è proprio il clone che predomina alla diagnosi a persistere anche alla recidiva. Il meccanismo che prevale, dunque, sembra essere la cosiddetta “branched evolution”, mentre la “linear evolution” parrebbe avere un ruolo marginale nello sviluppo delle recidive di LAL, come dimostrato anche da Oshima et al, 2016 (Figura VI).
Figura VI: Rappresentazione schematica del meccanismo di evoluzione clonale nella LAL in base a quanto proposto da Oshima K et al, 2016.
BIBLIOGRAFIA
Ematologia, Università “Sapienza”, Roma
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