NEWS FROM ASH 2018 (San Diego): Novità biologiche sulle neoplasie mieloproliferative croniche: la mutazione CALR

Dal 60° ASH Annual Meeting, in programma a San Diego (CA) dal 1° al 4 dicembre 2018.

La mutazione CALR è stata oggetto di tre studi principali.

“Haploinsufficiency of Calr confers hematopoietic stem cells (HSC) with a clonal advantage over wild-type cells, and, in settings of MPN, compensates for the functions of HSC impaired by the Calr mutation”, di Shide K et al, ha affrontato la problematica se le alterazioni funzionali osservate nelle cellule MN portanti la mutazione di CALR esprimessero solo la funzione della proteina mutata o anche la mancanza relativa (“aploinsufficienza”) della proteina normale. Utilizzando cellule knock-out (KO) per CALR si è osservato che queste mimano sostanzialmente le proprietà delle cellule con CALRdel52 circa le alterazioni dell’emopoiesi nei topi trapianti con cellule ingegnerizzate, e conferiscono un vantaggio clonale alle cellule staminali rispetto a quelle esprimenti l’allele wildtype. L’analisi comparativa del profilo di espressione di cellule CALRdel52 e KO ha messo in evidenza un simile coinvolgimento della via di segnalazione di STAT5, mentre quella di TNFalfa e IFNgamma risultava più marcatamente alterata nelle celle mutate rispetto alle KO. In sostanza questi dati indicano che la aploinsufficienza di CALR determina alterazioni nel profilo di espressione genica, influenzando la segnalazione di citochine proinfiammatorie, contribuendo ad alterare direttamente le cellule staminali.

“Absence of Calreticulin Phenocopies Cellular Abnormalities Induced By Calreticulin Exon-9 Mutation in Myeloproliferative Neoplasms”, di Calabresi L et al., ha presentato dati a sostegno dell’ipotesi che, in aggiunta alle alterazioni funzionali causate dal nuovo C-terminus della proteina mutata, largamente mediate dall’interazione con il recettore MPL (si veda di seguito), anche la perdita di funzione legata a domini presenti nella porzione terminale della proteina CALR wildtype contribuisca alle alterazioni funzionali delle cellule mutate. Mediante tecnologia CRISPR/Cas9 sono state create linee CALRdel52 e CLAR KO a partire dalle linee K562 e UT7-dipendente da trombopoietina. Si è osservato che il comportamento delle cellule KO era sovrapponibile alle cellule del52 nella proliferazione cellulare e l’induzione del differenziamento megacariocitario, in particolare la crescita citochina-indipendente delle cellule UT-7. Inoltre, cellule CD34+ di cordone ombelicale, trattate con la stessa metodologia a breve termine, hanno mostrato un significativo aumento della formazione di colonie megacariocitarie rispetto ai controlli. Lo studio fosfoproteomico nelle cellule KO ha mostrato il coinvolgimento di p38gamma, p70 S6KmTOR, e di ERk1 e 2, indicando l’attivazione di mTOR e MAPK. Uno degli effetti riportati nelle cellule di pazienti con MPN e omozigosi della mutazione di CALR è la marcata riduzione della proteina MPO nei granulociti. L’espressione della proteina MPO è stata riscontrata marcatamente ridotta nelle cellule di linea mieloide HL60 ingegnerizzate con CRIPSR/cCas9 per essere CALR KO o CALRdel52, e veniva normalizzata a seguito  dell’espressione forzata di CARL wildtype. Nel loro complesso, queste osservazioni suggeriscono che il nuovo C-terminus di CALR che origina dalle mutazioni dell’esone 9 comporta anche la perdita di alcune funzioni fisiologiche della proteina CALR normale, fenocopiando quindi la CARL mutata in un contesto MPL-indipendente.

“Secreted mutant calreticulin as rougue cytokines trigger thrombopoietin receptor activation specifically in CALR mutated cells: Perspectives for MPN therapy”, di Balligand T et al., presentato in sessione plenaria. Studi precedenti hanno portato evidenza a supporto di un meccanismo di trasformazione delle cellule da parte della proteina CALR mutata mediato dalla attivazione disregolata di MPL, recettore per la TPO. Lo studio in questione ha affrontato alcuni aspetti rimasti indefiniti, in particolare quale sia il compartimento cellulare nel quale avviene la interazione tra CALR mutato e MPL, se il complesso Calr/MPL sia dimostrabile sulla superficie cellulare e se la proteina CALR mutata sia secreta dalle cellule. I risultati principali hanno dimostrato che la proteina CALR mutata viene secreta nel plasma di topi Calrdel52 eterozigoti e di pazienti con MPN, con un livello mediano di 25,6 ng/ml, mostrando una discreta correlazione con il burden allelico del gene CALR mutato. Mediante un approccio di bioluminescence resonance energy transfer (BRET) è stata direttamente dimostrata l’interazione tra CALR mutata e MPL, anche in un sistema colturale nel quale le cellule venivano separate da una membrana (sistema in trans). Dati congruenti sono stati ottenuti anche nel modello murino, suggerendo quindi un possibile meccanismo autocrino e paracrino. Questo meccanismo potrebbe facilitare lo sviluppo, ai fini di sperimentazione clinica, di anticorpi diretti contro la proteina CALR mutata o di molecole inibenti l’interazione tra questa stessa e MPL sulla superficie cellulare.