Leucemia linfatica cronica

 

INTRODUZIONE

 

Rispetto alla visione storica che definiva la leucemia linfatica cronica (LLC) una malattia indolente da accumulo di piccoli linfociti, le conoscenze patogenetiche hanno consentito di riconoscere questa condizione come una malattia dinamica, che trae la sua origine da una ricca serie di eventi biologici e genetici primari e secondari. L’interazione con gli antigeni, lo stato di “attivazione” cellulare che ne segue e le complesse interazioni con il microambiente plasmano una malattia dal decorso eterogeneo, talora preceduta da una condizione predisponente, la linfocitosi B-monoclonale (monoclonal B-cell lymphocytosis, MBL) recentemente definita nei suoi contorni nosografici. Grazie ai progressi sulla comprensione dei meccanismi che governano la storia naturale della LLC l’approccio moderno alla gestione del paziente si avvale di una caratterizzazione clinica che prevede lo studio di una serie di marcatori prognostici, molto utili per l’adeguata programmazione di terapie sempre più efficaci, che includono oggi alcune molecole in grado di interferire con processi essenziali per la sopravvivenza e la crescita del linfocito neoplastico.

 

Definizione e cenni epidemiologici

 

La LLC è un disordine linfoproliferativo cronico che coinvolge i linfociti B CD5-positivi e che rientra tra le neoplasie a cellule B-mature della classificazione WHO (Muller-Hermelink HK et al, 2008). E’ più frequente nei maschi che nelle femmine (1,5-2,0/1), ed ha un’incidenza nei paesi occidentali, riferita a 100.000 abitanti, compresa tra 2-6 casi/anno, mentre è rara in Giappone e nei paesi orientali, ove l’incidenza è <1 caso/100.000 abitanti (Redaelli A et al, 2004) (Figura Ia).

L’età media alla diagnosi è attorno ai 70 anni, e l’incidenza aumenta da 1 caso/anno/100.000 abitanti nella fascia 40-50 anni a 20 casi nella fascia 70-80 anni. Oltre il 40% delle LLC è diagnosticata ad un’età >75 anni, mentre meno del 10% è diagnosticata prima dei 50 anni (Brenner H et al, 2008) (Figura Ib).

 

Figura I. a) incidenza nei diversi paesi; b) incidenza per età

 

 

Eziologia

 

L’eziologia della LLC non è nota. Non può essere escluso un ruolo per le radiazioni ionizzanti (Richardson DB et al, 2005), anche se lo studio della popolazione sopravvissuta all’incidente nucleare di Chernobyl ha mostrato un aumento di incidenza di molte forme di leucemia, ma non di LLC (Lin SL et al, 2009). Alcune attività agricole, con particolare riguardo all’impiego di pesticidi si possono associare ad un aumento dei casi di LLC (Caporaso N et al, 2004).

Vi è evidenza di una possibile associazione tra LLC e fattori genetici. La LLC ha un’incidenza bassa nelle popolazioni orientali rispetto agli occidentali e i gruppi etnici che migrano in altri paesi mantengono l’incidenza di questa malattia al livello di quella del paese di provenienza. Nei parenti di primo grado di soggetti affetti da LLC il rischio di sviluppo della malattia e di altre sindromi linfoproliferative (linfoma di Hodgkin e non Hodgkin) è superiore rispetto a quello della popolazione generale di pari età e sesso (Capalbo S et al, 2000; Goldin LR et al, 2004) e si possono rinvenire espansioni di piccoli cloni B linfocitari con fenotipo classico della LLC e negatività per CD38, con una frequenza francamente maggiore rispetto alla popolazione generale (Rawstron AC et al, 2002). In un’analisi di 24 famiglie con più di due membri affetti si è potuto documentare, accanto alle classiche anomalie citogenetiche, una elevata frequenza di delezioni o guadagno di materiale genetico a livello delle bande Xp11.1-p21, Xq21-qter, 2p12-14 e 4q11-21 (Martin AJ et al, 2002). E’ possibile che, diversamente dal cancro mammario, ove un gene (BRCA1) ha un importantissimo effetto, il substrato genetico della LLC consista nell’intervento di più geni con basso potenziale predisponente (Goldin LR et al, 2007).

 

Patogenesi

 

A cura di: Sara Martinelli (Struttura semplice di Ematologia- Unità operativa di Medicina Interna – Ospedale S. Chiara di Trento).

La patogenesi della LLC riconosce numerosi momenti (Tabella I), incentrati sulle particolarità della cellula d’origine, sulle sue interazioni con ipotetici antigeni e con il microambiente e sullo sviluppo di una vasta gamma di lesioni genetiche.

 

Tabella I: Momenti patogenetici nella LLC

 

 

a) Cellula d’origine

 

Per molto tempo l’espressione del CD5 da parte delle cellule della LLC ha fatto ritenere che la controparte cellulare normale fosse rappresentata dal subset di linfociti B-1 (definito nel topo, senza un chiaro corrispettivo nell’uomo), coinvolto nell’immunità innata e in grado di produrre anticorpi naturali mediante una reazione T-indipendente (Darzentas N et al, 2010). Nell’uomo, l’espressione di CD5 caratterizza le cellule B vergini, mentre viene persa dopo l’incontro con l’antigene. In una parte dei casi di LLC (50-80% nelle varie casistiche) la cellula leucemica presenta >2% di mutazioni somatiche nella sequenza del gene codificante per la porzione variabile delle catene pesanti delle Ig (IGHV), un processo (ipermutazione somatica) che fisiologicamente avviene all’interno del centro germinativo, grazie all’intervento di enzimi quali l’activation-induced cytidine deaminase (AID), in risposta ad antigeni T-dipendenti. La restante parte delle LLC presenta una configurazione “germline” della porzione variabile del gene Ig (i.e. <2% di mutazioni). Il passaggio attraverso il centro germinativo, che quindi caratterizza le LLC “mutate”, è tuttavia incompatibile con la derivazione dai linfociti B-1. Inoltre, lo studio del profilo di espressione genica ha mostrato ampia omogeneità tra i diversi casi di LLC, indipendentemente dallo stato mutazionale dei geni IGHV, ed è risultato somigliante a quello delle cellule B memoria CD27+. I casi di LLC “mutate” potrebbero quindi rappresentare l’espansione di cellule B memoria CD27+ che, in seguito all’incontro con un antigene T-dipendente, hanno attraversato le fasi del centro germinativo; i casi di LLC “non mutate” potrebbero invece derivare da una frazione minoritaria di cellule B CD27+ che hanno incontrato l’antigene in maniera T-indipendente ed hanno sviluppato un fenotipo “memoria” senza passaggio attraverso il centro germinativo (Klein U et al, 2001; Rosenwald A et al, 2001). L’espressione del CD5 potrebbe essere coerente con l’origine delle LLC “mutate” da un subset recentemente riconosciuto di cellule B memoria CD27+ CD5+, mentre per le LLC “non mutate” l’espressione del CD5 sarebbe suggestiva di una origine da cellule B vergini pre-centro germinativo, ipotesi sostenuta anche da alcuni studi di espressione genica (Seifert M et al, 2012), non potendo tuttavia escludere che il fenotipo di superficie possa essere stato alterato dal processo stesso di trasformazione o da uno stato di anomala attivazione e che quindi il CD5 sia comunque espresso da cellule che hanno effettivamente incontrato l’antigene (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
Accanto alle controversie relative all’origine della cellula B matura la cui espansione determina la malattia, recenti evidenze suggeriscono che le più precoci alterazioni genetiche ed epigenetiche che predispongono allo sviluppo della LLC si verifichino a monte, a livello della cellula staminale emopoietica pluripotente (HSCs). Per effetto di queste lesioni precoci, la cui natura non è al momento chiara, il destino di questi progenitori viene orientato verso il lineage B linfocitario, con successiva selezione, per effetto della stimolazione antigenica, di elementi maturi della loro progenie che vanno incontro ad un’espansione prima oligoclonale, quindi monoclonale per accumulo di ulteriori lesioni genetiche (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).

 

b) Ruolo della stimolazione antigenica

 

E’ noto che il clone trasformato nella LLC presenta un utilizzo preferenziale di alcune famiglie V, D e J (ad esempio VH1-69; VH4-34), che non riflette la frequenza di questi riarrangiamenti nella popolazione B-linfocitaria CD5 normale. Poiché queste sequenze, assemblate durante la maturazione B-linfocitaria intramidollare, formano la porzione variabile del gene Ig espressa in superficie come BCR, si può dedurre che alcuni antigeni sono in grado di ingaggiare i cloni esprimenti questi BCR favorendone l’espansione e la successiva trasformazione. Questo concetto è stato rafforzato dalla dimostrazione di “BCR stereotipati”, che presentano una identica sequenza che codifica per la porzione del BCR che lega l’antigene nota come “complementarity determining region” (CDR) (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008; Ghiotto F et al, 2004; Tobin G et al, 2004) . Vista la complessità degli eventi di ricombinazione che portano all’assemblaggio del BCR, la probabilità che due linfociti B normali possano avere casualmente un BCR stereotipato è dell’ordine di 10^-12, mentre è stato osservato che fino al 30 % dei casi di LLC può mostrare questo fenomeno (Stamatopoulos K et al, 2007). Tra gli antigeni in grado di ingaggiare il BCR nella LLC si annoverano gli elementi polisaccaridici batterici, il fattore reumatoide, il DNA, la cardiolipina, antigeni espressi sulle cellule apoptotiche (Caligaris-Cappio F, Ghia P, 2008). Si è così affermato in questi ultimi anni il concetto di una relazione patogenetica tra stimolazione antigenica, spesso sostenuta da autoantigeni, e LLC17. In effetti è stata fornita una recente elegante dimostrazione di come una proteina, nota come “catena pesante della miosina non-muscolare” (non muscle myosin heavy chain), avente un ruolo nel movimento cellulare, possa essere esposta sulla superficie delle cellule apoptotiche e di come la maggior parte della LLC “non-mutate” possa riconoscere tramite i suoi anticorpi questo antigene (Chu CC et al, 2010).

Esiste inoltre dimostrazione che il linfocito della LLC può mantenere la capacità di rispondere all’antigene a) andando incontro in vivo a switch di classe Ig (Malisan F et al, 1996) b) sviluppando nuove mutazioni del gene IGHV (Gurrieri C et al, 2002), c) esprimendo l’enzima AID (Oppezzo P et al, 2003), importante nel processo di ipermutazione somatica; d) modificando il profilo di espressione genica e attivando il ciclo cellulare (Guarini A et al, 2008). E’ interessante notare che queste caratteristiche sono più spiccate nei casi di LLC “non-mutate” CD38+ e ZAP-70+, rispetto alle altre LLC (Lanham S et al, 2003; Chen L et al, 2002). In effetti, nelle LLC “non-mutate”, il BCR-signaling è attivo, mentre nelle forme “mutate” è inattivo in seguito ad uno stato di anergia funzionale legato ad una protratta stimolazione antigenica, con conseguente desensibilizzazione del BCR stesso (Stevenson FK et al, 2004). Questa condizione di “anergia” si associa ad uno specifico profilo di espressione di geni coinvolti nel signaling BCR-mediato (Muzio M et al, 2008).

Il BCR signaling derivante dalla stimolazione antigenica comporta il coinvolgimento di una serie di molecole che regolano la vita del linfocito neoplastico (Burger JA, 2011). Alcune di queste molecole quali la Bruton tirosin chinasi (BTK) e la subunità delta della fosfatidil-inositol-3 chinasi (PI3K delta), rappresentano bersagli per terapie mirate di dimostrata efficacia (Foà R et al, 2013).

Recentemente è stata inoltre dimostrata la capacità, esclusiva dei BCRs dei linfociti neoplastici in corso di LLC, di attivare la cascata di segnalazione intracellulare indipendentemente da una stimolazione antigenica (Dühren-von Minden M et al, 2012). Questa proprietà sembra essere strettamente dipendente dall’interazione delle regioni HCDR3 dei BCRs dei linfociti leucemici con specifici epitopi intrinseci degli stessi BCRs. Presumibilmente solo alcune sequenze HCDR3 e alcuni specifici epitopi intrinseci hanno questa peculiarità, il che potrebbe giustificare la selezione di un ristretto repertorio di BCRs ed il fenomeno dei recettori stereotipati. Pur non escludendo il probabile contributo di una selezione antigenica specifica, questa ipotesi fornisce una spiegazione alternativa, antigene-indipendente, del fenomeno, ed individua un potenziale nuovo target terapeutico nell’inibizione del signalling autonomo del BCR in pazienti con LLC (Dühren-von Minden M et al, 2012).

 

c) Turn-over cellulare

 

 Contrariamente a quanto ritenuto nel recente passato, la LLC non può essere oggi considerata una patologia da accumulo di linfociti che non vanno incontro ad apoptosi. I linfociti patologici mantengono la sensibilità ad alcuni stimoli pro-apoptotici mediati da Fas e dal legame di anticorpi anti IgM che ingaggiano il BCR (Chu P et al, 2002; Zupo S et al, 2002) e proliferano in vivo ad un ritmo pari allo 0,1-1% dell’intero clone ogni giorno (Messmer BT et al, 2005). Il ritmo di divisione cellulare e di rinnovo è più elevato nella frazione cellulare CD38+ (Calissano C et al, 2009).

 

d) Interazioni con il microambiente

 

Nei linfonodi dei soggetti con LLC esiste un comparto di “accumulo” costituito da piccoli linfociti ed un comparto, quello dei “centri di proliferazione”, ricco in paraimmunoblasti e prolinfociti, ove le cellule mostrano i caratteri dell’attivazione e vanno incontro a divisione cellulare. Queste strutture istologiche, che conferiscono un quadro pseudofollicolare al linfonodo della LLC, si rinvengono anche nei tessuti infiammati dei soggetti affetti da patologia autoimmune (Humby F et al, 2009) e richiamano il concetto del ruolo della stimolazione da parte di autoantigeni nella genesi della LLC. Nei centri di proliferazione i prolinfociti e i paraimmunoblasti sono a stretto contatto con linfociti T CD4 e cellule follicolari dendritiche. Nel comparto di “accumulo” i piccoli linfociti interagiscono con cellule stromali mesenchimali e con cellule “nutrici” (“nurselike cells”) differenziatesi da monociti circolanti, in un contesto di interazioni cellula-cellula che ne favorisce la sopravvivenza. In effetti, la stimolazione da parte del CD40 ha un ruolo nel mantenimento in vita del clone B-linfocitario, al pari dell’interazione con i linfociti T CD4, in grado di determinare la produzione di citochine anti-apoptotiche (IL4, IFN) (Ghia P, Caligaris-Cappio F, 2000). L’importanza in vivo della presenza dei linfociti T CD4 è stata recentemente dimostrata in un modello murino immunodeficiente, in cui il trasferimento di cellule LLC dava origine alla malattia solo in presenza di linfociti T CD4 autologhi (Bagnara D et al, 2011). Le cellule T sono reclutate nel microambiente tumorale da chemochine prodotte dalle cellule leucemiche e ne favoriscono la sopravvivenza tramite interazioni cellulari, in particolare il legame CD40-CD40L. Le cellule leucemiche esprimono inoltre recettori inibitori e producono molecole solubili in grado di rendere inefficace l’attività delle cellule T CD4, CD8 ed NK e sfuggire così alla sorveglianza immunitaria (ten Hacken E, Burger JA, 2014)
Nella distribuzione e sopravvivenza delle cellule patologiche (Stevenson FK, Caligaris-Cappio F, 2004) giocano un ruolo importante a) alcune chemochine e loro recettori, espressi dal linfocito leucemico (CXCR3 e CXCR5), b) cellule del sangue periferico in grado di differenziarsi in cellule “nutrici” (“nurselike”), che favoriscono la sopravvivenza e la migrazione del linfocito all’interno degli spazi midollari attraverso lo stromal-derived growth factor (Burger JA et al,1999), c) le cellule dendritiche, attraverso il CD44 e grazie all’induzione dell’espressione di una proteina BCL2 correlata (Mcl-1) (Pedersen IM et al, 2002). L’angiogenesi può giocare un ruolo nelle fasi di accelerazione della malattia o nei sottogruppi più aggressivi, ove si riscontrano livelli serici più elevati di VEGF (Molica S et al, 2002; Maffei R et al, 2010).

 

e) Lesioni citogenetico-molecolari

 

– geni microRNA e TCL1
Nella LLC non è ad oggi nota la lesione genetica primaria in grado di innescare il processo di trasformazione, ma sono disponibili numerose informazioni su una serie di lesioni che governano il processo di trasformazione (Figura II).

 

Figura II. Stimolazione antigenica e lesioni citogenetico-molecolari nella patogenesi della LLC

 

Sono stati localizzati due geni codificanti per microRNA (i.e miR-15 e miR-16) nella regione 13q14, deleta in un 40-50% delle LLC. Questi geni mostrano ridotta espressione in seguito a delezione nella LLC (Calin GA et al, 2002) e, in queste condizioni, può risultare alterata l’espressione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare nei linfociti B, in particolare il gene antiapoptotico BCL-2. In effetti, la delezione di miR-15 e miR-16 nel topo determina l’insorgenza di un’espansione clonale di linfociti B che presenta le caratteristiche biologiche della LLC. La proliferazione linfoide è più marcata e aggressiva se la delezione coinvolge, oltre ai suddetti geni a microRNA, il gene DLEU2 che mappa nella stessa regione (Klein U et al, 2010). La concomitante delezione di DLEU7, posizionato all’interno della regione di minima delezione, può contribuire alla patogenesi per la perdita/riduzione della sua fisiologica funzione di inibizione di NF-kB (Palamarchuk A et al, 2010).
Nella LLC, inoltre, vi è una consistente overespressione del gene TCL1 che mappa a livello della banda 14q32.1, determinata da un meccanismo di demetilazione del promotore (Yuille MR et al, 2001) e/o da due geni a microRNA, miR-29 and miR-181 (Efanov A et al, 2010). Esiste la documentazione che il topo transgenico per un costrutto che contiene l’enhancer del gene Ig ed il gene TCL1 sviluppa un’espansione clonale B-CD5+, che con il passare del tempo assume le caratteristiche della LLC (Bichi R et al, 2002). Analogamente, il topo transgenico che iperesprime miR-29 nei linfociti B, può sviluppare la LLC (Santanam U et al, 2010). Il ruolo di TCL1 nella patogenesi della LLC è mediato dalla riduzione dell’attività della DNA metiltansferasi 3A con conseguente diminuzione della metilazione del DNA (Palamarchuk A et al, 2012).
La famiglia dei miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) risulta frequentemente ipoespressa nella LLC. Questi geni a miRNA sono target trascrizionali diretti di p53 e sono coinvolti nel pathways dell’apoptosi p53-mediata. Ridotti livelli di miR-34, associati o meno a del17p/ mutazione TP53 o a delezione 11q (ove sono situati i geni che codificano per miR-34b e miR34c) si associano a forme di malattia più aggressiva (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Il profilo di espressione di numerosi altri miRNA (tra i quali miR21, miR181, miR155) riveste un ruolo prognostico nella LLC (Bottoni A, Calin GA, 2014).
Studi recenti hanno dimostrato come diversi microRNA siano implicati a vario livello anche nella via di segnalazione del BCR e nelle interazioni con il microambiente (Balatti V et al, 2015), con un ruolo di regolazione della proliferazione e apoptosi delle cellule leucemiche che viene attualmente studiato come possibile target terapeutico (Bottoni A et al, 2016).

– Mutazioni geniche ricorrenti
Il sequenziamento del genoma di pazienti affetti da LLC (Puente XS et al, 2011; Fabbri G et al, 2011)

ha dimostrato che la LLC si associa a mutazioni di tipo non-silente di numerosi geni, in grado di alterare la funzione delle corrispondenti proteine. Queste mutazioni appaiono più frequenti delle lesioni che comportano perdita o guadagno di materiale genico e sono in genere variabili da paziente a paziente pur potendosi individuare alcuni pathways comunemente coinvolti: regolazione del ciclo cellulare e apoptosi, risposta al danno del DNA, processazione del RNA, vie di segnalazione intracellulare (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). Alcune di queste lesioni sono ricorrenti:

• Regolazione del ciclo cellulare e risposta al danno del DNA: oltre alle lesioni di TP53, trattate nel paragrafo 17p-, e di ATM, trattate nel paragrafo 11q-, tra i geni coinvolti nella riparazione/protezione del DNA è risultato mutato in maniera ricorrente POT1, codificante una componente del sistema di mantenimento dei telomeri e mutato in circa il 3% dei pazienti con LLC, tutti appartenenti al sottogruppo con IGHV non mutato (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016).
• Vie di segnalazione intracellulare: le lesioni di NOTCH1, presenti nel 10-15% dei casi, comportano l’accumulo di un’isoforma attiva della proteina che è in grado attivare il signalling intracellulare NOTCH1-correlato. I pazienti con questa mutazione presentano in genere una malattia relativamente aggressiva, associata al frequente sviluppo di farmacoresistenza e alla possibile tendenza all’evoluzione in sindrome di Richter . Le mutazioni di NOTCH1 sono più frequenti nei pazienti con IGHV non mutato e con la trisomia 12 (Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012).
• Oltre alla mutazione del gene stesso, multiple lesioni genetiche ricorrenti in pazienti con LLC sembrano convergere sull’attivazione della via di NOTCH1, in particolare la mutazione inattivante di FBXW7, il cui prodotto interviene nella degradazione della proteina NOTCH1, e una mutazione nella regione non codificante 3’ UTR di NOTCH1 che ne altera lo splicing (Puente XS et al, 2015; Fabbri G et al, 2016). L’effettiva incidenza della deregolazione della via di NOTCH1 nella LLC potrebbe quindi essere sottostimata.
• Diverse mutazioni ricorrenti nella LLC si traducono invece nell’attivazione del complesso trascrizionale NF-kB. BIRC3 codifica per una proteina che down-regola il signalling di NF-κB e presenta mutazioni inattivanti nel 20% circa delle LLC chemio-refrattarie. La frequenza di queste mutazioni è bassa (<5%) nelle fasi iniziali della malattia (Rossi D et al, 2012). Le lesioni di MYD88, rinvenute nel 5% dei casi e con maggior frequenza nelle LLC con geni IGHVmutati,  comportano la deregolazione di multipli pathways di segnalazione intracellulare con attivazione di target diversi tra cui NF-kB e STAT3 (Fabbri G, Dalla-Favera R, 2016). In una piccola frazione di pazienti (1-3%), accomunati da un decorso aggressivo, risulta invece inattivato il gene NFKBIE che codifica un regolatore negativo diretto (IkBe) di NF-kB (Mansouri L et al, 2015).
• Processazione RNA: Nel 5% delle LLC alla diagnosi si ritrovano mutazioni del gene SF3B1, che codifica per una proteina coinvolta nello splicing del RNA. Le conseguenze della mutazione di SF3B1 nella patogenesi della LLC sono state recentemente studiate con un’analisi trascrittomica che ha dimostrato l’alterazione di meccanismi di riparazione del DNA, di mantenimento delle sequenze telomeriche e, nuovamente, del signalling di NOTCH1 (Wang L et al, 2016). Queste mutazioni sono più frequenti nelle LLC con 11q- (Wang L et al, 2011), si associano ad uno stadio più avanzato, allo stato non mutato dei geni IGHV e alla positività per ZAP70 (Quesada V et al, 2011). Anche questa lesione, al pari delle mutazioni di NOTCH1 si rinviene più frequentemente nelle LLC chemiorefrattarie (Rossi D et al, 2011).

E’ interessante notare come le mutazioni di TP53, NOTCH1, SF3B1 e BIRC3 siano nella maggior parte dei casi mutualmente esclusive nei casi di LLC refrattari alla fludarabina, per cui è ragionevole ipotizzare che oltre a TP53, le vie del signaling di NOTCH1 ed NF-κB e il sistema dello splicing possano giocare un ruolo indipendente nella genesi della chemiorefrattarietà.

Il progresso delle tecniche di sequenziamento del DNA (next generation sequencing) ne ha consentito l’applicazione su grandi coorti di pazienti (Puente XS et al, 2015; Landau DA et al, 2015). Il sequenziamento dell’intero genoma codificante in 538 casi di LLC (Landau DA et al, 2015) ha individuato mutazioni ricorrenti a carico di due ulteriori pathways con ruolo patogenetico importante: i geni PTPN11 e FUBP1 sono modulatori dell’attività di MYC, mentre le mutazioni di NRAS, KRAS e BRAF implicano il coinvolgimento della via di segnalazione MAPK-ERK. Le lesioni ricorrenti di RPS15, coinvolto nel processo di splicing, e di IKZF3, fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dei linfociti B, si sono rivelate mutazioni “driver” precedentemente non note nella patogenesi della malattia (Landau DA et al, 2015). Un dato estremamente interessante è emerso dal sequenziamento su larga scala (506 pazienti) anche delle regioni non codificanti del genoma dei casi di LLC, con l’identificazione di mutazioni ricorrenti in queste sequenze in grado di modificare l’espressione di geni codificanti. Le più rilevanti sono la mutazione ricorrente della regione 3’ UTR di NOTCH1, che ne altera il processo di splicing con delezione del dominio PEST e incremento della stabilità della proteina, e la mutazione a carico di una regione enhancer del cromosoma 9p13, che si associa ad una ridotta espressione del fattore di trascrizione PAX5, essenziale nel differenziamento B-linfocitario (Puente XS et al, 2015).

– Telomeri
I telomeri sono costituiti da sequenze ripetute di DNA che conferiscono stabilità alla struttura dei cromosomi. Con l’invecchiamento della cellula ed in seguito ai cicli replicativi a cui questa va incontro si assiste ad un accorciamento dei telomeri, che viene normalmente limitato dall’attività delle telomerasi. Nella LLC i telomeri dei linfociti patologici sono più corti rispetto ai linfociti B normali di soggetti di pari età e sesso. Inoltre l’accorciamento dei telomeri è più spiccato nelle LLC “non-mutate”, nelle quali si rinviene anche una maggiore attività telomerasica (Damle RN et al, 2004; Grabowski P et al, 2005) e si associa ad una prognosi sfavorevole e ad un’aumentata probabilità di sviluppare la sindrome di Richter (Rossi D et al, 2009). Queste osservazioni indicano come la storia replicativa della LLC sia differente a seconda dello stato mutazionale dei geni Ig e come nei casi più aggressivi vi sia stato uno stimolo proliferativo nelle fasi di emergenza del clone neoplastico in grado di indurre numerosi cicli di attivazione e replicazione con accorciamento, disfunzione e fusione dei telomeri e conseguente insorgenza di esteso danno del genoma (Lin TT et al, 2010).
Un recente lavoro di sequenziamento del genoma in pazienti con LLC familiare ha dimostrato la presenza di mutazioni germline proprio a carico di geni coinvolti nel mantenimento dei telomeri (in particolare POT1), sottolineando come la disregolazione di questi fini meccanismi di protezione del DNA svolga un ruolo chiave nella patogenesi della LLC (Speedy HE et al, 2016).

 

Anomalie citogenetiche

 

L’introduzione della FISH ha permesso l’individuazione di aberrazioni cromosomiche in circa l’80% dei casi di LLC e ogni paziente viene oggi incluso in uno specifico gruppo in base a una classificazione citogenetica gerarchica che attribuisce importanza decrescente alle seguenti lesioni: 17p- > 11q- > +12 > 13q-. I risultanti gruppi citogenetici hanno una frequenza diversa a seconda dello stadio di malattia, come riportato in Tabella II.

 

Tabella II. Frequenza (% di casi) di aberrazioni cromosomiche alla FISH, di lesioni genetiche e stato mutazionale IGHV in >4000 casi di LLC arruolati nei protocolli del GCLLSG (*)

 

Recentemente, l’introduzione di una stimolazione efficace delle mitosi mediante oligonucleotidi e IL2 ha mostrato che approssimativamente il 30% delle LLC senza difetti cromosomici mediante analisi FISH in interfase può presentare una lesione cromosomica nel cariotipo all’analisi citogenetica e come questi pazienti “FISH normali” con anomalie citogenetiche nel cariotipo abbiano una prognosi sfavorevole (Rigolin GM et al, 2012). Inoltre, è stato dimostrato con questa tecnica che cariotipi complessi potevano essere documentati in una significativa frazione dei casi in associazione con fattori prognostici e quadro clinico sfavorevole (Haferlach C et al, 2007; Rigolin GM et al, 2015). Un quadro riassuntivo del significato delle principali lesioni citogenetiche è presentato in Tabella III.

 

Tabella III: Significato clinicobiologico dei difetti cromosomici ricorrenti nella LLC

 

Nuove sottili aberrazioni sono state identificate mediante sensibilissime tecniche di scansione dell’intero genoma, grazie alla quale sono state documentate lesioni genetiche in virtualmente tutti i casi di LLC (Grubor V et al, 2009).

 

13q-

 

A cura di: Danilo G. Faraci, Antonio Cuneo, Ematologia, Università di Ferrara

La delezione 13q14 è la più frequente anomalia citogenetica nella LLC e viene identificata alla FISH in più del 50% dei casi. Questa delezione è stata descritta come eterozigote in approssimativamente il 75-80% dei casi e omozigote nel restante 20-25%. Studi molecolari hanno dimostrato che la regione comunemente deleta comprende 790 kb tra i marcatori D13S1150 e D13S25.
Pekarsky et al (Pekarsky Y e Croce CM, 2015) hanno individuato tra i geni target della delezione 13q14, un cluster di 30 kb tra gli esoni 2 e 5 del gene DLEU2 codificante per due microRNA (miR-15a/miR-16-1) in grado di regolare la funzione di molteplici oncogeni, principale dei quali risulta essere BCL-2. Tale proteina, nella maggioranza dei casi di LLC, risulta overespressa, facendo intendere pertanto la funzione oncosoppressoria di miR-15a e miR-16-1. La delezione di questi geni per microRNA è stata recentemente confermata da altri ricercatori che hanno utilizzato CGH array ad alta risoluzione in 58 casi di LLC (Buhl AM et al, 2006).
Nel 2010, Klein et al (Klein U et al, 2010) hanno evidenziato che, se nel topo transgenico la delezione è ampia, coinvolgendo sia il cluster miR-15/16-1 che altri loci mappati su DLEU2, anche la malattia assume un decorso più grave, con una proliferazione linfoide più marcata ed aggressiva.
La categoria di pazienti che non presentano altre anomalie cromosomiche associate alla delezione 13q14 è quella a prognosi più favorevole con intervallo tra diagnosi e inizio del trattamento e sopravvivenza superiori rispetto alla LLC con cariotipo normale.
Tuttavia alcune differenze in termini di predittività del decorso clinico sono state osservate in rapporto a, i) delezione eterozigorte o omozigote, ii) grandezza del clone con delezione, iii) ampiezza delle delezione.
Garg R et al, 2012 hanno dimostrato che i pazienti con delezione eterozigote e quelli con delezione omozigote presentano un andamento clinico sovrapponibile. Tale evidenza smentirebbe precedenti ipotesi secondo le quale i pazienti omozigoti potrebbero presentare una maggiore cinetica di crescita linfocitaria rispetto agli eterozigoti.
Individui con un’alta percentuale di cellule con nuclei deleti sembrano avere un decorso più aggressivo della malattia, rientrando a tutti gli effetti nella categoria di rischio citogenetico intermedio (Van Dyke DL et al, 2010).
Dal Bo et al (Dal Bo M et al, 2011) hanno stabilito come cut-off il 70% di nuclei del clone con delezione 13q14, e hanno diviso i casi di LLC del loro studio in quattro sottogruppi: pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, pazienti con <70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1, pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione non comprendente RB1, e pazienti con >70% nuclei 13q- con delezione comprendente RB1. Di questi, solo il primo gruppo manteneva una prognosi favorevole, mentre gli altri tre presentavano un decorso clinico simile alla LLC con cariotipo normale, con diminuzione di TFT e OS. La delezione di oltre il 70% di nuclei delle cellule del clone appare quindi come un marker indipendente di progressione, con impatto maggiore rispetto all’ampiezza della delezione stessa. Tale dato veniva confermato da Van Dyke et al (Van Dyke DL et al, 2016), (dimostrando che i pazienti aventi >85% nuclei 13q- presentano un’evoluzione clinica peggiore, con TFT sovrapponibile a quelli aventi cariotipo normale o trisomia 12.
La minima regione deleta (MDR) del 13q include i loci DLEU2/MIR15A/MIR161, mentre nei casi con ampia delezione il segmento perso può comprendere anche il gene RB1 (banda 13q14.1-q14.2). Xiong et al (Xiong W et al, 2015) hanno dimostrato, mediante l’utilizzo di sonde specifiche per MDR e RB1 alla FISH, che i pazienti aventi un’ampia delezione presentano TFT e OS nettamente più brevi rispetto ai pazienti aventi minima delezione. Tale dato veniva invece contraddetto dai ricercatori canadesi della British Columbia, i quali hanno evidenziato almeno 9 possibili combinazioni di delezione 13q14 a seconda dei geni deleti e della presenza dell’alterazione in entrambi gli alleli o meno. Più comunemente l’ampia delezione risulta monoallelica (55%), fattore che potrebbe spiegare l’impatto non significativo del coinvolgimento del gene RB1 nell’outcome dei pazienti (Huang SJ et al, 2016). Pure Haferlach et al (Haferlach C et al, 2012) hanno dimostrato che l’ampia delezione non influisce negativamente sul TFT. Data la discrepanza dei risultati ottenuti finora dai diversi studi, pertanto il significato prognostico dell’ampiezza della delezione 13q14 risulta poco chiaro e rimane ad oggi un’interessante questione scientifica.
In conclusione, il gruppo di pazienti con 13q- isolata parrebbe essere non omogeneo, in quanto recenti studi hanno messo in evidenza che la percentuale di cellule del clone che presentano nuclei deleti sia in grado di influenzare il decorso e la prognosi della malattia, con la conseguente necessità di ridefinirne il rischio in base a tale parametro. Per quanto riguarda l’ampiezza della delezione stessa, ulteriori studi sono necessari. Risulta evidente che l’implicazione clinica della delezione 13q14 assume quindi un significato più complesso di quanto originariamente attribuitogli.

 

Trisomia 12

 

A cura di: Carmine Liberatore, Antonio Cuneo – Ematologia Università di Ferrara

La trisomia del cromosoma 12  si riscontra nel 15% circa dei pazienti con LLC e rappresenta la più frequente acquisizione di materiale cromosomico (Strefford JC, 2015). Insieme alla del 13q14, è una delle anomalie cromosomiche più precoci nella patogenesi della LLC e permane stabilmente nel decorso della malattia (Foà R, Guarini A, 2013).
La trisomia 12 è spesso associata a varianti morfologiche di LLC (LLC atipica e LLC/PLL) (Strefford JC, 2015; Scarfò L et al, 2016).
Oltre la trisomia del cromosoma 12, sono riportati casi di LLC con trisomia parziale, secondaria a duplicazione di segmenti cromosomici compresi tra le bande 12q13 e 12q22.
Nella regione 12q13-15 è localizzato il gene MDM2, il cui prodotto aumenta il legame di TP53 all’ubiquitina, provocandone la degradazione. In tal modo, l’iperespressione di MDM2 determina una riduzione nella capacità di TP53 di arrestare il ciclo cellulare e di indurre l’apoptosi a seguito di un danno al DNA, esitando in una minore sensibilità delle cellule leucemiche alla chemioterapia e in una maggiore farmacoresistenza. Nella regione 12q22 mappa il gene CLLU1, che risulta upregolato nella LLC con decorso clinico aggressivo (Strefford JC, 2015; Shahjahani M et al, 2015).
Secondo l’originale classificazione citogenetica gerarchica della LLC, la trisomia 12 viene classificata come lesione a prognosi intermedia (Scarfò L et al, 2016).
Ad oggi, con l’impiego della chemio-immunoterapia, la presenza isolata di trisomia 12 risulta associata ad una buona risposta alla chemio-immunoterapia e ad una più lunga sopravvivenza rispetto all’impiego della sola chemioterapia (OS a 10 anni del 70% circa) (Strefford JC, 2015; Foà R, Guarini A, 2013). I migliori risultati ottenuti con l’impiego della chemio-immunoterapia sono probabilmente legati all’elevata espressione di CD20 sulle cellule leucemiche, nei casi che non presentano mutazioni di NOTCH1 associate (Strefford JC, 2015; Shahjahani M et al, 2015).

La trisomia del cromosoma 12 presenta una peculiare associazione (24-28%) con le mutazioni del gene NOTCH1 (approfondimenti nella sezione “patogenesi”), associazione che risulta particolarmente elevata nelle LLC con trisomia 12 e IGHV non mutato (41,9%) (Strefford JC, 2015; Del Giudice I et al, 2012; Balatti V et al, 2012; Scarfò L et al, 2016). La trisomia 12 associata a mutazione di NOTCH1 identifica un sottogruppo di pazienti con malattia biologicamente più aggressiva, maggiore tendenza allo sviluppo di farmacoresistenza e all’evoluzione in sindrome di Richter. Il rischio di evoluzione in sindrome di Richter risulta particolarmente elevato quando la trisomia 12 si associa all’utilizzo del recettore IGHV 4-39 con la HCDR3 stereotipata (Rossi D et al, 2009b). Clinicamente, nei pazienti con trisomia 12 e mutazione di NOTCH1, l’utilizzo di rituximab in associazione a fludarabina e ciclofosfamide non ha determinato gli stessi benefici osservati per la trisomia 12 isolata, con una prognosi peggiore e una minore sopravvivenza globale  in risposta alla chemio-immunoterapia (OS a 10 anni 21-45%) (Foà R, Guarini A, 2013; Shahjahani M et al, 2015; Del Giudice I et al, 2012; Scarfò L et al, 2016).

 

11q-

 

A cura di: Antonio Urso, Antonio Cuneo – Ematologia Università di Ferrara

Questa anomalia può essere individuata nel 7-25% dei casi a seconda dello stadio della malattia.
I pazienti con 11q- mostrano in genere una malattia contrassegnata da adenopatie estese (comprese masse bulky) e, negli studi iniziali, presentavano un’età mediana inferiore ai 60 anni con un intervallo libero da trattamento e una sopravvivenza più brevi rispetto ad altre LLC (Döhner H et al, 1997).
Da un punto di vista biologico i casi di LLC con 11q-, si associano a stato mutazionale IGHV non mutato, CD38+ (Dewal GW et al, 2003), oltre che instabilità genomica, come dimostrato dallo sviluppo di alterazioni cromosomiche aggiuntive mediante analisi del cariotipo (Fegan C et al, 1995).

Il segmento comunemente deleto include il gene dell’atassia teleangectasia (ATM) che è coinvolto nel processo di trasduzione del segnale attivato in risposta a rotture del DNA. Il rimanente allele ATM è mutato in circa il 30% delle LLC con 11q-, l’inattivazione del secondo allele ATM si associa ad un ulteriore riduzione della sopravvivenza (Austen B et al, 2007).
Inoltre il segmento comunemente deleto comprende nella maggioranza dei casi (80-90%) il gene BIRC3 (regolatore negativo della via alternativa di signaling NF-kB), mentre solo una piccola percentuale presenta mutazioni di BIRC3. A differenza di ATM la presenza di delezioni o mutazioni a carico di BIRC3 non sembrerebbe alterare la prognosi delle LLC 11q- (Rose-Zerilli MJ et al, 2014).

Secondo alcuni autori sarebbe possibile stratificare le LLC 11q- sulla base della percentuale di positività della FISH per tale lesione citogenetica, permettendo di individuare in pazienti non trattati chi presenterà un intervallo libero da trattamento, sopravvivenza e risposta al trattamento migliore nonostante la presenza della 11q- (Marasca R et al, 2013; Jain P et al, 2015).

In diversi trial clinici la presenza di 11q- si associava a percentuali di risposta completa più bassa e a una breve sopravvivenza libera da progressione (Catovsky D et al, 2007; Grever MR et al, 2007; Eichhorst BF et al, 2006). Tuttavia, l’aggiunta di rituximab alla tradizionale chemioterapia con fludarabina e ciclofosfamide nei pazienti più giovani ha migliorato la percentuale di risposta completa e la sopravvivenza libera da progressione (Tsimberidou AM et al, 2009; Hallek M et al, 2010) e vi è evidenza non ancora consolidata che il trapianto di midollo osseo allogenico con condizionamento a ridotta intensità potrebbe superare l’impatto prognostico sfavorevole dell’11q- nella LLC (Sorror ML et al, 2008). Negli studi più recenti, anche grazie all’introduzione di regimi di chemio-immunoterapia efficaci, il valore prognostico avverso della delezione 11q è risultato di minore importanza, essendo mantenuto nell’analisi del gruppo cooperatore tedesco (Pflug N et al, 2014) ed assente perché superato da altri marcatori più riproducibili nell’International prognostic index (International CLL-IPI working group, 2016).

 

17p-/TP53 mutato

 

A cura di: Maurizio Cavallari, Antonio Cuneo – Ematologia Università di Ferrara

Il gene oncosoppressore TP53, sito al locus 17p13, codifica per la proteina p53. Una mutazione a carico di TP53 ovvero la delezione 17p13 (aploinsufficienza) determinano la perdita della funzione della proteina p53. Questa condizione ha come ripercussione la perdita del controllo del ciclo cellulare, a causa del ruolo di sorveglianza che p53 svolge sul processo di replicazione del DNA. La funzione di p53 si esplica in caso di danno al DNA, venendo attivata attraverso ATM e determinando l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi (Berger AH et al, 2011).
In corso di LLC la del17p13 è spesso associata ad una mutazione inattivante dell’allele TP53 residuo, mentre la mutazione a carico di TP53 può avvenire indipendentemente dalla del17p13 e determinare l’obsolescenza di p53 attraverso un effetto dominante negativo oppure attraverso un processo di duplicazione di un segmento cromosomico contenente TP53 mutato (disomia uniparentale) (Zenz T et al, 2008).
Le anomalie della via di TP53 sono alla base della resistenza all’apoptosi e della instabilità genetica, per cui i pazienti portatori di del17p13 hanno spesso anomalie cromosomiche complesse e molteplici lesioni genetiche (Stilgenbauer S et al, 2014; Haferlach C et al, 2007; Herling CD et al, 2016). L’impatto prognostico sfavorevole sulla OS della del17p13 è stato ben documentato oltre 20 anni fa da Dohner et al (Dohner H et al, 1995) ed un ruolo simile è stato definito per la mutazione di TP53 indipendentemente dalla presenza della del17p13 (Gonzalez D et al, 2011; Zenz T et al, 2010; Rossi D et al, 2009b). Piccoli cloni recanti la mutazione a carico di TP53 (<20% delle cellule), studiati mediante tecniche di next generation sequencing, sono stati riconosciuti parimenti responsabili di un peggiore outcome (Rossi D et al, 2014). Numerosi lavori sono concordi nel definire un impatto sfavorevole sui principali indicatori di outcome (PFS, OS) sia della del17p13 che della mutazione di TP53 in relazione al trattamento con alchilanti, analoghi purinici ed anti-CD20 indipendentemente dalla presenza di M-IGHV e di uno stadio precoce (Martinelli S et al, 2016). Le anomalie di TP53 sono state associate inoltre ad elevata probabilità di chemiorefrattarietà (Dohner H et al, 1995; Zenz T et al, 2010; Oscier D et al, 2010) e ad un aumentato rischio di progressione nel contesto di pazienti con LLC recidiva/refrattaria trattata con inibitori del pathway del BCR (Byrd JC et al, 2013; Woyach JA et al, 2014).
La forza dell’impatto prognostico sfavorevole delle mutazioni di TP53/del17p13 è stata universalmente accettata, e recentemente inserita nel sistema di stratificazione prognostica CLL-IPI (International CLL-IPI working group, 2016). Questo ha avuto notevoli ripercussioni sulla scelta terapeutica già alla I linea di trattamento, in quanto la presenza di mutazioni di TP53/del17p13 suggerisce di evitare trattamenti chemio-immunoterapici e di prediligere trattamenti che sfruttino un meccanismo citotossico p53-indipendente (NCCN, 2017; Cramer P et al, 2016). L’impiego dei nuovi inbitori del pathway del BCR e degli anti-BCL2 hanno apportato un significativo incremento delle risposte al trattamento nei pazienti portatori delle mutazioni di TP53/del17p13 mitigando l’impatto su PFS ed OS di queste aberrazioni (Byrd JC et al, 2015; Furman RR et al, 2014; Roberts AW et al, 2016).

 

Cariotipo complesso

 

A cura di: Maurizio Cavallari, Francesca Maria Quaglia e Antonio Cuneo

Per definizione, il cariotipo complesso (CC) è caratterizzato dalla presenza di almeno tre aberrazioni cromosomiche all’interno di uno stesso clone, identificate mediante analisi citogenetica convenzionale (Mayr C et al, 2006; Haferlach C et al, 2010) e rappresenta una condizione a significato prognostico sfavorevole nei pazienti affetti da LLC. Studi di confronto tra FISH e citogenetica convenzionale hanno evidenziato che nel 25-37% dei casi di LLC con FISH “negativa” è possibile riscontrare la presenza di anomalie citogenetiche non altrimenti identificabili e che nel 20% dei casi queste sono inquadrabili in un CC, evidenziando una possibile sottostima del rischio citogenetico (Rigolin GM et al, 2012). Diversi studi hanno documentato l’associazione del CC con numerose anomalie genetiche, di cui le più frequenti sono a carico di TP53, ATM, FBXW7 e MYD88, una condizione che riflette un’instabilità genomica sottostante (Rigolin GM et al, 2016; Le Bris Y et al, 2016; Herling CD et al, 2016; Puiggros A et al, 2017).
Inoltre sono state riportate comuni associazioni con marcatori prognostici sfavorevoli consolidati, quali le aberrazioni di TP53 (Haferlach C et al, 2007; Baliakas P et al, 2014; Herling CD, 2016; Le Bris Y et al, 2016; Rigolin GM et al, 2016; Rigolin GM et al, 2017; Puiggros A et al, 2017; Rigolin GM et al, 2017), lo stato mutazionale IGHV non mutato (Haferlach C et al, 2007; Baliakas P et al, 2014; Le Bris Y et al, 2016; Rigolin GM et al, 2017; Puiggros A et al, 2017), l’espressione del CD38 (Baliakas P et al, 2014; Puiggros A et al, 2017; Rigolin GM et al, 2017), la presenza di delezioni di ATM (Baliakas P et al, 2014; Le Bris Y et al, 2016; Puiggros A et al, 2017; Rigolin GM et al, 2017) ed uno stadio di malattia avanzato (Puiggros A et al, 2017; Rigolin GM et al, 2017).
L’impatto prognostico sfavorevole del CC è stato correlato a una peggiore overall survival (OS) (Badoux XC et al, 2011a; Badoux XC et al, 2011b; Rigolin GM et al, 2015; Le Bris Y et al, 2016; Herling CD et al, 2016; Puiggros A et al, 2017; Rigolin GM et al, 2017), a un peggiore time to first treatment (TFT) (Rigolin GM et al, 2017) e ad una inferiore progression free survival (PFS) (Badoux XC et al, 2011a; Badoux XC et al, 2011b; Le Bris Y et al, 2016), con un potere predittivo negativo sulla sopravvivenza, indipendente dall’indice prognostico CLL-IPI, nei pazienti non pretrattati (Rigolin GM et al, 2017).
L’introduzione della target therapy ha riacceso l’attenzione clinica sul ruolo prognostico del CC, evidenziandone un possibile significato sfavorevole indipendente nei pazienti con LLC recidivata o refrattaria trattati con ibrutinib o con venetoclax (Thompson PA et al, 2015; Anderson MA et al, 2017).

 

Evoluzione clonale nella LLC

 

A cura di: Sara Martinelli

Moderne metodiche di sequencing hanno documentato come alcune lesioni possano rappresentare eventi “primari” (driver) coinvolgenti l’intera popolazione clonale (13q-, +12, mutazioni di NOTCH1 o di MYD88), mentre altre (17p-/mutazioni TP53, 11q-/mutazioni di ATM, mutazioni SF3B1) spesso rappresentano lesioni che compaiono con l’evoluzione clonale (Puente XS, López-Otín C, 2013). E’ noto che una frazione di LLC acquisisce anomalie cromosomiche durante la storia naturale della malattia. In uno studio prospettico (Stilgenbauer S et al, 2007;
Goldin LR et al, 2007) 11 pazienti su 64 (17%) seguiti per una mediana di 42 mesi hanno mostrato evoluzione clonale con una del(17)(p13) in 4 casi, del(6)(q21) in 3 casi, del(11)(q23) in 2 casi, +(8)(q24) in 1 caso ed evoluzione da 13q- eterozigote a omozigote in tre casi. La comparsa tardiva di 11q- nella LLC è stata associata con l’evoluzione della malattia (Cuneo A et al, 2002). Un recente studio di sequenziamento dell’intero esoma eseguito su un’ampia coorte di pazienti alla diagnosi e poi alla recidiva ha dimostrato come l’evoluzione clonale post-terapia rappresenti la regola piuttosto che l’eccezione nella LLC: nel 30% dei casi il clone predominante alla recidiva era già identificabile a livello subclonale prima del trattamento e in una buona parte dei restanti casi era comunque possibile individuare precocemente, con analisi mirate di deep sequencing, almeno una delle lesioni genetiche “driver” della recidiva (Landau DA et al, 2015). Pertanto l’analisi dell’architettura clonale della malattia  pre-terapia può anticipare l’evoluzione delle lesioni genetiche alla recidiva. Lo stesso lavoro ha evidenziato come la trisomia 12, del(13q) e del(11q), considerate eventi primari precoci, tendano a rimanere stabilmente clonali anche alla recidiva nonostante pattern complessi di evoluzione clonale; al contrario le mutazioni di TP53 e la del(17p), in genere subclonali all’esordio, risultano nettamente più rappresentate alla recidiva testimoniando un vantaggio di sopravvivenza sotto la spinta selettiva esercitata dalla terapia. Lo stesso vantaggio selettivo non è stato documentato per altre lesioni “tardive” quali le mutazioni di SF3B1 e ATM (Landau DA et al, 2015). Nello stesso paziente può esserci una eterogeneità clonale tra il sangue periferico ed il microambiente linfonodale; quest’ultimo può contribuire alla selezione di anomalie genetiche sfavorevoli che possono poi apparire anche nel sangue periferico alla recidiva (Del Giudice I et al, 2016).

 

Diagnosi

 

A cura di: Enrico Lista, Francesca Maria Quaglia e Antonio Cuneo

La LLC viene diagnosticata nella maggior parte dei casi in occasione di esami del sangue routinari in pazienti asintomatici. Una minoranza dei casi mostra già alla diagnosi un quadro clinico conclamato con adenopatie e/o splenomegalia, segni di insufficienza midollare secondaria a diffusione della malattia, sintomi sistemici e, raramente, localizzazioni extranodali (vide infra). Dopo aver escluso la presenza di infezioni in grado di determinare linfocitosi reattiva (Tabella IV), si procede con gli esami di laboratorio necessari per la diagnostica differenziale dei disordini linfoproliferativi cronici (Tabella V), o con la rara linfocitosi B persistente policlonale (Salcedo I et al, 2002), condizione più frequente nelle giovani donne fumatrici che presenta tendenza alla distribuzione familiare.
La diagnostica della LLC si basa sulla valutazione combinata dell’esame emocromocitometrico, dell’analisi citofluorimetrica per la determinazione dell’immunofenotipo e dell’analisi morfologica dello striscio di sangue periferico.
La morfologia tipica mostra piccoli linfociti a cromatina addensata (Figura III) e le ombre di Gumprecht, che rappresentano linfociti rotti durante la preparazione dello striscio a causa di una loro intrinseca fragilità, determinata dalla riduzione della proteina del citoscheletro vimentina (Nowakowski GS et al, 2010).

Tabella IV: Condizioni associate a linfocitosi reattiva

 

Tabella V: Caratteristiche di laboratorio distintive dei disordini linfoproliferativi cronici.

 

Figura III. a) LLC tipica. Si noti la presenza di piccoli linfociti con ombre di Gumprecht (*); b) LLC atipica (mixed-cell type). Si noti la presenza di una maggioranza di piccoli linfociti e di un grande linfocito (**).

 

Per la definizione diagnostica della LLC, secondo le linea guida del 2008 dell’International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (iwCLL), devono essere soddisfatti due criteri (Hallek M et al, 2008):

• conta B-linfocitaria assoluta nel sangue periferico di ≥5000/mL, con una morfologia di piccoli linfociti maturi;
• dimostrazione della clonalità dei linfociti B circolanti mediante citoflorimetria del sangue periferico.

L’analisi immunofenotipica, secondo lo “score Matutes”, consente di porre diagnosi di LLC in presenza di una espansione di elementi CD19+, CD5+, CD23+, con CD22 e/o CD79b debolmente positivo e debole espressione delle immunoglobuline di superficie (sIg) associata a restrizione delle catene leggere (rapporto K/ >3 o <3) e negatività per FMC7. E’ utile l’applicazione dello score immunofenotipico che, attribuendo 1 punto a CD5+, CD23+, CD22/CD79b+ debole o negativo, sIg+ debole e FMC7-, identifica, in presenza di uno score ≥3, oltre il 95% dei casi di LLC (Matutes E et al, 1994; Moreau EJ et al, 1997), permettendone la distinzione rispetto alle altre sindromi linfoproliferative (Tabella V).

Recentemente è stata proposta una modifica del classico score Matutes, in considerazione dell’alta espressione del CD200 nella LLC. Il nuovo punteggio diagnostico, definito “CLL Flow Score” si basa sulla formula:

%CD200⁺ + %CD5/CD23 – %CD79b⁺ – %FMC7⁺

Un valore superiore allo zero depone per la diagnosi di LLC. Il nuovo score ha lo scopo di assicurare l’alta sensibilità dello score Matutes, aumentandone però la specificità. (Köhnke T et al, 2017). Se ne attende l’eventuale recepimento da parte delle linee guida.
Forme aventi solo linfoadenopatie con biopsia positiva per LLC, ma con una conta periferica assoluta B linfocitaria minore di 5000/µL, vengono classificate come Linfoma a Piccoli Linfociti (Small Lymphocytic Lymphoma, “SLL”). Quindi, lo SLL si distingue dalla LLC solo per l’assenza di linfocitosi, avendo però le identiche caratteristiche patologiche e immunofenotipiche della LLC. Perciò le due forme sono considerate due manifestazioni cliniche della stessa patologia.
La diagnostica viene completata con le indagini indicate in Tabella VI, necessarie per una corretta stadiazione, la stratificazione in gruppi a prognosi distinta e per una corretta programmazione della terapia.

 

Tabella VI: Valutazione diagnostica nella LLC

Nella classificazione attuale, pazienti con una conta linfocitaria assoluta minore di 5000/µL e assenza di manifestazioni di malattia (linfoadenomegalie, organomegalie), ricevono una diagnosi di Linfocitosi B Monoclonale (Monoclonal B lymphocytosis, “MBL”). Tale condizione si ritrova nel 12% degli individui sani (Nieto WG et al, 2009).

L’aggiornamento WHO distingue due forme di MBL:

• la MBL “low-count” definita da una conta di linfociti LLC periferici < 500/µL, caratterizzata da una minima o nulla possibilità di progressione e che non richiede un follow-up ematologico ma solo generale (Vardi A et al, 2013; Rawstron AC et al, 2010);
• la MBL “high-count” con conta linfocitaria compresa tra 500 e 5000/µL, che richiede un follow-up ematologico periodico e ha delle caratteristiche cliniche e genetico/molecolari molto simili alle LLC di stadio RAI 0 (Morabito F et al, 2013).

 

Clinica

a) Manifestazioni principali

 

Circa il 70% dei pazienti viene diagnosticato in seguito ad esami ematici routinari che dimostrano linfocitosi asintomatica, con obiettività negativa o con adenopatie diffuse a poche sedi (Johnson JB , 2009). Può essere presente già alla diagnosi ipogammaglobulinemia. Negli stadi intermedi compaiono, nelle principali sedi superficiali, adenopatie non dolenti, di consistenza parenchimatosa, non dura, associate o meno a splenomegalia. Gli stadi avanzati contemplano, per definizione, la presenza di anemia o piastrinopenia secondarie a infiltrazione midollare. Le stadiazioni di Rai e di Binet (Rai KR et al, 1975; Binet JL et al, 1981) sono riassunte nella Tabella VII, ove è anche riportata la sopravvivenza media nei diversi stadi di malattia.

 

Tabella VII: Classificazione di Rai e di Binet

 

E’ importante escludere la natura autoimmune dell’anemia e della piastrinopenia prima di assegnare un paziente allo stadio III-IV di Rai o C di Binet (Oscier D et al, 2004) in quanto è noto che la prognosi degli stadi avanzati è migliore se la citopenia è di origine autoimmune piuttosto che da infiltrazione midollare (Zent CS et al, 2008). Le moderne terapie citostatiche e di supporto, unite al miglioramento delle condizioni generali di salute della popolazione adulta, hanno determinato un significativo allungamento dell’aspettativa di vita negli stadi avanzati rispetto ai dati storici (Shanafelt TD et al, 2009; Abrisqueta P et al, 2009; Kristinsson SY et al, 2009).
I sintomi, quando presenti, possono essere riferiti alla presenza di adenopatie massive o di imponente epatosplenomegalia e alla presenza di insufficienza midollare con segni legati all’anemia o alla piastrinopenia. Può manifestarsi astenia non associata ad anemia significativa. Sintomi sistemici, quali febbre >38°C senza cause apparenti, dimagramento >10% di peso corporeo, sudorazione profusa, prurito, dolori muscolari sono presenti alla diagnosi in una minoranza dei casi, mentre possono comparire più frequentemente nelle fasi avanzate di malattia e/o di resistenza al trattamento. La malattia può esordire con complicanze infettive, espressione di deficit del sistema immunitario legato alla malattia e alle terapie. L’anemia emolitica autoimmune può comparire in qualunque fase della malattia; in generale la disregolazione del sistema immunitario, incentrata sui meccanismi presentati in Tabella VIII, può manifestarsi con le patologie a genesi autoimmune elencate in Tabella IX (Dearden C et al, 2008).

 

Tabella VIII: Difetti immunitari nella leucemia linfatica cronica (LLC).

 

Tabella IX: Complicanze autoimmuni nella leucemia linfatica cronica (LLC).

 

 

b) Quadro evolutivo

 

A cura di: Francesca Maria Quaglia e Antonio Cuneo

Il decorso clinico e la sopravvivenza dei pazienti affetti da LLC sono variabili: alcuni soggetti rimangono asintomatici e non richiedono trattamento per anni, mentre altri presentano andamento clinico aggressivo, difficilmente controllabile dalla terapia. La gestione clinica dei pazienti affetti da LLC è assai migliorata negli ultimi anni, grazie all’introduzione di utili marker prognostici, di nuovi agenti terapeutici e al miglioramento delle terapie di supporto. Tuttavia, negli stadi clinici più avanzati sono presenti manifestazioni sistemiche correlate all’anemia e alla trombocitopenia e al coinvolgimento di organi e apparati (fegato, milza, reni e midollo osseo). Linfoadenomegalie superficiali e splenomegalia sono presenti nel 90% dei casi; un’epatomegalia si riscontra nel 50% dei casi. Spesso la causa del decesso è una malattia intercorrente, poiché i pazienti sono solitamente soggetti anziani (Castoldi G e Liso V, 2013).

 

– Infezioni

A cura di: Francesca Maria Quaglia e Antonio Cuneo

Le complicanze infettive sono state da sempre tra le principali cause di morbidità e mortalità nei pazienti affetti da LLC (Kjellander C et al, 2016; Andersen MA et al, 2019; Eichhorst B et al, 2019). La patogenesi dell’aumentato rischio infettivo nella LLC è multifattoriale: entrano in gioco fattori legati alla malattia, fattori legati all’ospite e alle terapie specifiche effettuate (Montserrat E e Campo E, 2006). La LLC è caratterizzata da una profonda disregolazione immunitaria. Sono state descritte alterazioni dell’immunità cellulo-mediata (Maharaj K et al, 2017), alterazioni del complemento (Randhawa JK, Ferrajoli A, 2016) e della via immunitaria umorale, con frequente ipogammaglobulinemia (Freeman JA et al, 2013; Friman V et al, 2016). Soprattutto negli stadi avanzati, i pazienti sono soggetti ad infezioni recidivanti, sia a causa della neutropenia da infiltrazione midollare, sia come conseguenza delle terapie che possono aggravare il deficit immunitario intrinseco della LLC (Castoldi G, Liso V, 2013). Gli agenti alchilanti e gli analoghi delle purine si associano prevalentemente ad infezioni batteriche. Una complicanza infettiva frequente è l’Herpes zoster (Kjellander C et al, 2016). Sono state descritte, nei pazienti in terapia con anticorpi monoclonali (mAb) anti-CD20, riattivazioni di HBV (Riedell P e Carson KR, 2014; Eichhorst B et al, 2019) e rari casi di leucoencefalopatia multifocale progressiva (PML) da JC virus (Herold T et al, 2012). L’uso su larga scala, al di fuori dei trial clinici, delle nuove terapie target recentemente approvate per la LLC sta facendo emergere infezioni opportunistiche da Legionella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Candida e Aspergillus (Williams AM et al, 2018; Chamilos G et al, 2018). Il medico ematologo deve essere in grado di prevenire e riconoscere precocemente tali infezioni, per mettere in atto tutte le strategie necessarie a salvaguardare un paziente fragile quale quello affetto da LLC. Il rischio di infezioni opportunistiche da Cryptococcus neoformans (Baron M et al, 2017), Mucor (Pouvaret A et al, 2019) e Fusarium spp, di riattivazioni di HBV e di polmoniti gravi da Pneumocystis jirovecii (Kreiniz N et al, 2018) in pazienti in trattamento con ibrutinib è stato evidenziato solo di recente (de Weerdt I et al, 2017; Brown JR, 2018; Varughese T et al, 2018). Idelalisib in associazioni terapeutiche o in popolazioni di pazienti non precedentemente autorizzate è stato associato ad un aumento degli eventi avversi gravi e dei decessi per cause infettive, principalmente polmoniti da P. jirovecii e Citomegalovirus (CMV) (de Weerdt I et al, 2017.
L’uso profilattico di farmaci antimicrobici (Brown JR, 2018) e la terapia di supporto con immunoglobuline endovena (IVIG) variano nei diversi centri (Randhawa JK, Ferrajoli A, 2016). Utile è il ricorso ad alcuni tipi di vaccinazioni (Randhawa JK, Ferrajoli A, 2016; Brown JR, 2018; Svensson T et al, 2018; Eichhorst B et al, 2019).
Nel 2018 l’International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (iwCLL) ha introdotto nella revisione delle Linee Guida (Hallek M et al, 2018) un breve aggiornamento sulla valutazione iniziale e sulla profilassi delle complicanze infettive, prima e durante la terapia della LLC. Nel 2019 sono state pubblicate le raccomandazioni della Società Italiana di Ematologia per il controllo delle infezioni nei pazienti affetti da LLC trattati con ibrutinib o idelalisib (Zinzani PL et al, 2019; Cuneo A et al, 2019). Vi è in questo momento un urgente bisogno di linee guida che si basino sui risultati dei trial ma comprendano anche dati tratti dalla pratica clinica, per un adeguato utilizzo dei nuovi farmaci e per la gestione delle loro tossicità, in particolare degli eventi avversi infettivi (Molica S, 2017; Brown JR, 2018; Iskierka-Jażdżewska E, Robak T, 2019).

 

– Seconde neoplasie

A cura di: Enrico Lista, Francesca Maria Quaglia e Antonio Cuneo

I pazienti affetti da LLC presentano un rischio aumentato rispetto alla popolazione generale di sviluppare neoplasie secondarie (ematologiche e non-ematologiche), che ne rappresentano una delle principali cause di morte. L’incidenza di seconde neoplasie nella LLC è di 1,2-2,2 volte maggiore di quella attesa in una popolazione di pari età (Tsimberidou AM et al, 2009b).
Un ampio studio retrospettivo con più di 16.000 pazienti affetti da LLC arruolati nel programma “Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER)” seguiti con un follow-up di 5,2 anni, ha mostrato un’incidenza di seconde neoplasie nell’11% dei pazienti (Hisada M et al, 2001).
Anche la linfocitosi B monoclonale (MBL) è associata ad un aumentato rischio di neoplasie secondarie non ematologiche (Solomon BM et al, 2012).
Le forme più frequenti sono le neoplasie cutanee (con un rischio aumentato di 8 volte (Manusow D et al, 1975) e a seguire i tumori prostatici, mammari, gastrointestinali e polmonari (Travis LB et al, 1992).
I principali fattori di rischio sono rappresentati dall’età avanzata, dal sesso maschile, da livelli elevati di LDH e beta2-microglobulina e creatinina (Tsimberidou AM et al, 2009b).
I meccanismi patogenetici che giustificano l’aumentata incidenza di neoplasie non sono ancora del tutto chiari. Un ruolo importante è probabilmente svolto dallo stato di immunosoppressione tipico della LLC, in particolare riguardo alla disfunzione T-cellulare (Greene MH et al, 1978). Altro fattore ipotizzato è quello correlato agli effetti dei trattamenti della LLC, ma i dati al riguardo sono discordanti. Uno studio ha dimostrato l’assenza di differenze di incidenza di seconde neoplasie nei pazienti non trattati e trattati con chlorambucil (Callea V et al, 2006).
Dibattuti sono i dati riguardanti l’effetto della chemio-immunoterapia, in particolare secondo schema FCR (fludarabina, ciclofosfamide e rituximab). E’ noto infatti che il trattamento con agenti alchilanti e analoghi purinici predispone allo sviluppo di seconde neoplasie. L’aggiunta del rituximab inoltre potenzia lo stato di immunosoppressione. Dati storici non associano l’utilizzo degli analoghi delle purine a un significativo incremento del rischio di seconde neoplasie (Jennifer A et al, 2009). Uno studio (Cheson BD et al, 1999) ha confrontato il numero di neoplasie secondarie osservate e attese in 724 pazienti con LLC recidivata/refrattaria trattati con fludarabina con un follow-up mediano di 7,4 anni: si evidenziava un maggior numero di neoplasie secondarie rispetto alle attese in soggetti sani, ma non rispetto ai pazienti affetti da LLC non trattati.
L’utilizzo di terapie di combinazione contenenti fludarabina correla invece con una maggiore incidenza di leucemia acute mieloide (LAM) e mielodisplasie (SMD) secondarie (Morrison VA et al, 2002; Tam CS et al, 2006). Uno studio dell’MD Anderson (Benjamini O et al, 2015) ha mostrato che il trattamento di prima linea con FCR si associava a un rischio di 2,38 volte di sviluppare seconde neoplasie, rispetto alla popolazione generale. In particolare l’incidenza di LAM e SMD era del 5,1% durante il follow-up di 4,4 anni, in linea con i dati precedenti (Zhou Y et al, 2012). I fattori di rischio erano l’età maggiore di 60 anni e il sesso femminile. La maggiore incidenza nelle donne potrebbe spiegarsi con la maggiore mielotossicità causata da differenze di farmacodinamica della chemio-immunoterapia. Anche alte dosi cumulative di ciclofosfamide sono state associate a un aumentato rischio per SMD-LAM (Benjamini O et al, 2015; Zhou Y et al, 2012; Xu Y et al, 2013). La fludarabina potenzia il danno al DNA indotto dagli agenti alchilanti e ne riduce la capacità di riparazione. Ciò si traduce clinicamente in un tempo minore allo sviluppo di SMD/LAM dopo terapia con agenti alchilanti (Yamauchi T et al, 2001; McLaughlin P et al, 2005). Bisogna però sottolineare che l’incidenza delle SMD è probabilmente sovrastimata a causa di un quadro di citopenie ritardate e dei cambiamenti displastici indotti dalla chemioterapia.
Il follow-up del trial CLL8 che confrontava FC e FCR in prima linea ha mostrato, a una mediana di osservazione di 5,9 anni, un’incidenza di seconde neoplasie del 15,3%, di cui il 40,4% di neoplasie solide, 14% di neoplasie cutanee, 17,6% di neoplasie ematologiche e il 27,9% di trasformazioni in sindrome di Richter . L’incidenza non risultava aumentata rispetto alla popolazione generale di pari età (Fisher K et al, 2015).
In generale le neoplasie secondarie a LLC hanno un decorso più aggressivo e una sopravvivenza inferiore rispetto alle forme non associate a LLC, in particolare nelle neoplasie mammarie, prostatiche, cutanee e del colon-retto (Solomon BM et al, 2013; Royle JA et al, 2011; Girschik J et al, 2008). La causa della differente prognosi è probabilmente legata alla minor efficacia del sistema immunitario che favorisce così l’invasione locale e le metastasi. Sembrano svolgere un ruolo importante anche le precedenti terapie per la LLC. È possibile, infatti, che la deplezione T cellulare indotta dalla fludarabina sia responsabile del diverso comportamento biologico delle cellule neoplastiche. A tal proposito si è notato che le forme secondarie al trattamento con fludarabina sembrano avere un decorso più sfavorevole (Benjamini O et al, 2015).

 

– Trasformazione istologica

A cura di: Francesca Maria Quaglia e Antonio Cuneo

La sindrome di Richter (SR) rappresenta lo sviluppo di un linfoma aggressivo in un paziente affetto da LLC (Agbay RLM et al, 2016). E’ una condizione relativamente rara, che può verificarsi nel 5-10% dei pazienti affetti da LLC (Rossi D et al, 2008). La forma più frequente (90-95% dei casi) è la SR variante Diffuse Large B-cell lymphoma (DLBCL). Più raramente (5-10% dei casi) è possibile lo sviluppo di un Hodgkin lymphoma (HL) (Tsimberidou AM et al, 2006). Si parla in questo caso di SR variante Hodgkin, HvRS (Tadmor T et al, 2014). La SR è caratterizzata da un rapido deterioramento clinico con brusca comparsa di sintomi sistemici, aumento asimmetrico dei linfonodi, splenomegalia ed epatomegalia, versamenti nelle cavità sierose e cachessia. La diagnosi, sospettata clinicamente, laboratoristicamente e radiologicamente, necessita della conferma istologica su biopsia di un linfonodo ingrandito (Rossi D e Gaidano G, 2009). I meccanismi patogenetici della SR non sono ancora ben definiti. L’accumulo di molteplici lesioni genetiche suggerisce che nella SR vi sia una instabilità genomica che predispone le cellule neoplastiche alla trasformazione (Fülöp Z et al, 2003). Una questione ancora non risolta riguarda il ruolo delle precedenti terapie per la LLC nello sviluppo della SR e in particolare il ruolo dei nuovi farmaci, che dovrà essere valutato dopo un maggiore follow-up (Vitale C e Ferrajoli A, 2016). Non esiste consenso sul miglior approccio terapeutico per i pazienti con SR, che presentano risposte limitate alle terapie standard e sopravvivenza mediana di 8-12 mesi (Tsimberidou AM et al, 2006b). L’introduzione di nuovi agenti terapeutici in combinazione con la chemio-immunoterapia richiede urgente e viva attenzione (Pagel JM, 2017).
La trasformazione in leucemia a prolinfociti è una evenienza poco frequente e si contraddistingue, per la comparsa nel sangue periferico e nel midollo osseo di cellule linfoidi con caratteristiche morfologiche del tutto sovrappponibili a quelle presenti nella leucemia prolinfocitica (Prolymphocytic Leukemia, PLL). Clinicamente questa fase della malattia si caratterizza per la comparsa di un rapido decadimento fisico, per la refrattarietà ai trattamenti chemioterapici, l’ingravescenza della splenomegalia, la prognosi infausta (sopravvivenza mediana: 14 mesi) (Castoldi G e Liso V, 2013).

 

Terapia della LLC

 

La terapia della LLC viene definita nell’ambito di un articolato processo decisionale, che deve tener presente tutti i seguenti aspetti:

a) quando iniziare il trattamento;
b) l’età e le condizioni cliniche generali del paziente;
c) le caratteristiche cliniche della malattia;
d) alcune caratteristiche biologiche;
e) i risultati dei trial clinici.

 

a) Inizio della terapia

 

Esiste evidenza, ben documentata (CLL Trialists’ Collaborative Group, 1999), che il trattamento precoce degli stadi iniziali o intermedi nei pazienti con malattia stabile e asintomatica non prolunga la sopravvivenza rispetto ad una vigile attesa seguita dalla terapia somministrata al momento dell’evoluzione clinica. Questi dati, riferiti ad un’epoca in cui la terapia disponibile era il clorambucile, non hanno ad oggi trovato smentita nonostante la disponibilità da almeno un decennio di agenti di maggiore efficacia rispetto al clorambucile, quali fludarabina, alemtuzumab, bendamustina e combinazioni di chemioterapia e rituximab. Il trattamento in fase iniziale espone il paziente al rischio di infezioni e, in un 2% circa dei casi, al rischio di morte correlabile al trattamento, a fronte di una probabilità di rimanere asintomatici con malattia stabile, pari al 49% dopo 11 anni per i pazienti in stadio A di Binet (Dighiero G et al, 1998). Un trial che ha randomizzato ad un trattamento precoce con fludarabina rispetto alla classica vigile attesa i pazienti con fattori di rischio biologico sfavorevole (IGHV non mutato, FISH sfavorevole, CD38+) che, in media, richiedono terapia dopo 2-6 anni dalla diagnosi (Shanafelt TD et al, 2010; Morabito F et al, 2009), non ha prodotto alcun vantaggio di sopravvivenza nei pazienti trattati (Hoechstetter MA et al, 2017). Analoghi risultati sono stati ottenuti impiegando il regime FCR (vide infra) rispetto alla vigile attesa in pazienti in stadio iniziale con LLC ad alto rischio di progressione (Herling CD et al, 2020).

Un recente studio non ancora pubblicato e presentato all’International Workshop on CLL nel 2019 da Langerbeins in rappresentanza del GCLLSG (studio CLL12), ha arruolato pazienti asintomatici, ma ad alto rischio di progressione, paragonando la classica vigile attesa alla terapia orale con l’inibitore della Bruton tirosin chinasi ibrutinib (vide infra). Lo studio ha dimostrato una più lunga sopravvivenza libera da progressione (PFS) nei pazienti che ricevevano ibrutinib, un numero di eventi avversi paragonabile nelle due braccia del protocollo, con tuttavia una percentuale di fibrillazione atriale significativamente più alta nel braccio interventistico, in assenza di differenze della sopravvivenza.

Vi è pertanto attualmente unanime consenso sul concetto di non trattare i pazienti asintomatici, in stadio iniziale o intermedio che non presentano adenopatie massive, indipendentemente dalla presenza alla diagnosi di uno o più fattori di rischio biologico. I principali criteri che pongono indicazione all’inizio della terapia (Hallek M et al, 2018) sono elencati in Tabella X.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabella X: Criteri per iniziare il trattamento nella LLC

 

 

 

b) Età e condizioni cliniche

 

I dati demografici dimostrano che il paziente con LLC ha un’aspettativa di vita inferiore alla popolazione di pari età (Shanafelt TD, 2009) e che questa differenza può non essere evidente nei casi diagnosticati ad un’età >75 anni (Shanafelt TD et al, 2010).
Nella programmazione della terapia è importante tener presente le condizioni del paziente e sono oggi disponibili alcuni strumenti di valutazione oggettiva, quali il Cumulative Illness Rating Scale, riprodotto in Tabella XI (Parmelee PA et al, 1995), che, pur non essendo stati concepiti per saggiare la tollerabilità alla chemioterapia, sono ampiamente utilizzati nei trial clinici. Ad esempio, non venivano arruolati nello studio che valutava l’efficacia di FCR rispetto a FC i pazienti con un CIRS >6 (Extermann M et al, 1998; Hallek M et al, 2010)

 

Tabella XI: Cumulative IIIness Rating Scale. Da Panmalee PA, et al. J Am Geriatr Soc 1995;43:130-137

 

Importanza nella scelta della terapia è da riservare alla valutazione della funzionalità renale, non solo come livelli di creatinina e azotemia, ma valutando la clearance della creatinina che, se < 70 ml/min, deve imporre cautela nell’impiego dei moderni regimi di chemioimmunoterapia impieganti fludarabina. Di pari importanza è la storia anamnestica relativa a pregresse infezioni, specialmente nei pazienti pretrattati.

 

c) Le caratteristiche cliniche della malattia

 

Il paziente può richiedere trattamento per una chiara espansione della malattia a livello emato-midollare, oppure per un prevalente progressivo coinvolgimento linfonodale. (Grever MR et al, 2007). Talora i pazienti con LLC richiedono terapia per condizioni indirettamente collegate alla malattia, in particolare per le manifestazioni autoimmuni riportate in Tabella IX. Tra queste le più frequenti sono rappresentate dall’anemia emolitica autoimmune (AEA) o dalla piastrinopenia autoimmune. L’approccio terapeutico dell’AEA, che può presentarsi alla diagnosi o, più frequentemente, durante il decorso della malattia e nei pazienti pretrattati (Mauro FR et al, 2000), è incentrato sull’utilizzo degli steroidi, che producono risposte globali nel 90% dei casi, con scomparsa dell’emolisi nel 60-70% dei casi. Una proposta di algoritmo terapeutico dell’AEA in corso di LLC è schematizzata in Figura IV (Dearden C, 2008).

 

Figura IV. Trattamento dell’anemia emolitica autoimmune nella LLC

 

 

d) Caratteristiche biologiche

 

In generale, la conoscenza dei fattori prognostici o predittivi di risposta è utile nell’orientare medico e paziente sulle strategie terapeutiche.

Al momento del trattamento di prima linea o alla ricaduta, la determinazione della delezione 17p e delle mutazioni di TP53 sono oggi assolutamente necessarie per programmare una terapia diversificata, incentrata su inibitori del signaling intracellulare o di BCL2 (vide infra).

E’ anche necessario determinare in laboratori qualificati e accreditati lo stato mutazionale delle porzioni variabili del gene immunoglobulinico (IGHV) in quanto nei pazienti con IGHV non mutato la chemioimmunoterapia è meno efficace.  Nella pratica clinica si possono inoltre presentare frequentemente condizioni nelle quali la terapia di induzione prescelta o il numero totale di cicli di chemioimmunoterapia da somministrare può essere il frutto di un ragionamento che soppesa le condizioni generali del paziente, il grado di aggressività della malattia e la tolleranza al trattamento.

 

e) I risultati dei trial clinici

 

L’efficacia e la tollerabilità dei regimi chemio/immunoterapici di più comune impiego nella pratica clinica è riassunta in Tabella XII (prima linea) e in Tabella XIII (successive linee di trattamento).

 

Tabella XII: Efficacia e tollerabilità dei principali schemi di chemioimmunoterapia di prima linea

 

Tabella XIII: Efficacia e tollerabilità dei regimi di chemioimmunoterapia di seconda linea nella LLC

 

In uno scenario in rapidissima evoluzione, si stanno accumulando i dati relativi all’impiego di farmaci biologici che interferiscono con il signaling intracellulare o con l’attività di BCL2 (Figura V), oggi impiegati anche in combinazione esclusivamente nell’ambito di trial clinici (vide infra).

 

Figura V: Farmaci biologici che interferiscono con il signaling intracellulare o con l’attività di BCL2

 

Oggi sono entrati nella pratica clinica ibrutinib, idelalisib e venetoclax. I dati dei principali studi relativi a queste molecole sono riassunti in Tabella XIV (prima linea) e in Tabella XV (pazienti recidivati o refrattari).

 

 

 

 

 

 

 

Tabella XIV: Efficacia e tollerabilità degli agenti biologici ibrutinib, idelalisib + rituximab e venetoclax nella terapia di prima linea della LLC.

 

 

 

 

 

 

 

 

Tabella XV: efficacia e tollerabilità di degli agenti biologici ibrutinib, idelalisib + rituximab e venetoclax nella LLC recidivata/refrattaria

 

 

I risultati dei trial clinici devono essere trasferiti ai pazienti comuni tenendo conto che, di norma, la popolazione affetta da LLC ha un’età mediana più alta (Figura VI) e un numero di comorbidità maggiore rispetto a quelle dei pazienti arruolati negli studi (Figura VII), dato che può comportare un aumento degli eventi avversi e delle sospensioni anche con i nuovi farmaci biologici (Ghia P and Cuneo A, 2016).

 

Figura VI: Frequenza della LLC nella popolazione statunitense stratificata per fasce d’età a confronto con l’età mediana dei pazienti affetti da LLC arruolati in alcuni trial clinici.

 

Figura VII: Numero medio di comorbidità nei pazienti affetti da LLC stratificati per età.

 

 

Terapia: considerazioni generali

 

L’approccio attuale alla terapia della LLC tiene conto delle seguenti considerazioni:

1) La combinazione di fludarabina e ciclofosfamide con l’aggiunta di rituximab (FCR) migliora la sopravvivenza nel paziente giovane e/o in buone condizioni generali rispetto alla migliore chemioterapia, rappresentata da fludarabina e ciclofosfamide (Hallek M et al, 2010). La combinazione alternativa che associa bendamustina e rituximab appare meglio tollerata e per lo meno altrettanto efficace rispetto a FCR nei pazienti anziani (i.e.≥65 anni)  in buone condizioni di salute (Eichhorst B et al, 2016). Entrambe le terapie possono ottenere remissioni profonde con negatività della malattia minima residua in una parte significativa dei casi (Eichhorst B et al, 2014). In particolare, i pazienti senza delezione 17p, senza mutazioni TP53 e con IGHV mutato possono avere remissioni complete e durature nel 60-70% dei casi con il regime FCR (Fisher K et al, 2015; Thompson PA, 2016; Rossi D, 2015). Nei pazienti con 17p- o mutazioni di TP53 questa terapia, al pari di altre chemioimmunoterapie, è di scarsa efficacia e non deve quindi essere usata (vide infra)..

2) Il controllo della sintomatologia, ottenibile con terapie meno aggressive, può essere vantaggioso nella popolazione anziana (Eichhorst BF et al, 2009). Tuttavia, studi retrospettivi hanno dimostrato un prolungamento della sopravvivenza rispetto a controlli storici nei pazienti anziani trattati con fludarabina in associazione a rituximab (Woyach JA et al, 2013). Inoltre, nei pazienti con comorbidità, l’aggiunta al clorambucile del nuovo anticorpo monoclonale anti CD20 obinutuzumab ha consentito di ottenere risposte complete con negativizzazione della malattia minima residua in una parte significativa dei casi, di migliorare la sopravvivenza rispetto al clorambucile da solo e di prolungare la PFS rispetto all’associazione del clorambucile con l’anticorpo anti CD20 di prima generazione rituximab (Goede V et al, 2014). Infine, l’aggiunta dell’anticorpo monoclonale anti CD20 ofatumumab al clorambucile ha consentito di ottenere un aumento significativo della percentuale di risposte alla terapia con negativizzazione della malattia minima residua in una parte dei casi ed un prolungamento della PFS (Hillmen P et al, 2015).

Le terapie con nuovi farmaci biologici, impegnati in prima linea hanno inoltre fornito importantissime informazioni, illustrate in dettaglio nella tabella XIV e qui di seguito riassunte, che hanno cambiato l’approccio terapeutico della LLC:

• Ibrutinib migliora la sopravvivenza rispetto al solo clorambucile (Burger I et al, 2015).
• Ibrutinib migliora la PFS, ma non la sopravvivenza globale rispetto alla chemioimmunoterapia nel paziente anziano (Woyach JA et al, 2018; Moreno et al, 2019). La PFS migliora nettamente con ibrutinib solo nei pazienti con IGHV non mutato.
• Ibrutinib migliora la PFS rispetto a FCR nei pazienti giovani e in buone condizioni e con IGHV non mutato. La sopravvivenza è migliore con ibrutinib, ma non è disponibile il dato stratificato per profilo mutazionale IGHV (Shanafelt TD et al, 2019)
• Venetoclax e l’anticorpo monoclonale anti CD20 obinutuzumab producono risposte profonde con negativizzazione della malattia minima residua (i.e. <10-⁴ cellule residue nel sangue periferico) e migliorano la PFS, ma non la sopravvivenza, rispetto alla combinazione clorambucile e obinutuzumab nel paziente con comorbidità. Il vantaggio di PFS è ben documentato solo nei pazienti con IGHV non mutato (Fischer K et al, 2019). Questa terapia, diversamente dalle altre terapie con nuovi farmaci, viene somministrata per un periodo definito (12 cicli ogni 28 giorni).
• Nei pazienti con 17p- la terapia di prima linea può avvalersi, oltre che di ibrutinib, anche di venetoclax in caso di fallimento o di controindicazioni all’impiego di ibrutinib o di idelalisib e rituximab in caso di controindicazioni all’utilizzo di altre terapie. Queste terapie si sono dimostrate efficaci nei pazienti con 17p- o mutazione di TP53 (Hallek M, 2019)

3) I risultati di tutte le chemioimmunoterapie, sia nel giovane che nell’anziano, sono decisamente deludenti nei pazienti con delezione 17p e/o con mutazione di TP53. In questi pazienti i risultati ottenuti in prima linea non vanno oltre una mediana di 18 mesi di PFS con alemtuzumab (oggi non più in commercio) e alte dosi di steroide, o un modesto 18% di pazienti liberi da progressione a 3 anni con FCR. L’unica opzione che ottiene una prolungata remissione in questi pazienti è il trapianto allogenico. Oggi le prospettive appaiono decisamente migliori grazie all’introduzione in commercio di nuove terapie biologiche (ibrutinib, idelalisib e venetoclax).

4) Nei pazienti con LLC ricaduta refrattaria le nuove terapie orali che bloccano il signaling mediato dal BCR o BCL2 hanno prodotto risultati di grandissimo interesse in termini di risposta, sopravvivenza libera da progressione e tollerabilità (Tabella XV) e hanno cambiato il paradigma di trattamento  di questa fase della malattia, essendo efficaci anche in presenza di malattia plurirecidivata e/o refrattaria ed in presenza della delezione 17p (Foà R, Guarini A, 2013; Byrd JC et al, 2013; Furman RR et al, 2014). Ibrutinib, che inibisce BTK e idelalisib (associato a rituximab), che inibisce PI3K, rappresentano assieme all’inibitore orale di BCL2 venetoclax (Roberts AW et al, 2015; Stilgenbauer S et al, 2016) i trattamenti di scelta per la LLC recidivata e refrattaria. Questi trattamenti vengono somministrati sino a progressione.

La combinazione venetoclax e rituximab utilizzata per un periodo di due anni nella LLC recidivata/refrattaria, si è dimostrata in grado di produrre risposte profonde con negativizzazione della malattia minima residua, migliorando la sopravvivenza libera da progressione e la sopravvivenza globale rispetto alla combinazione BR (Seymour JF et al, 2018).

 

Terapia di prima linea

 

a) Pazienti in buone condizioni di salute e senza delezione 17p- o mutazione di TP53

 

La terapia di prima linea nei pazienti giovani in buone condizioni e nella minoranza di anziani che presentano condizioni generali ottimali può essere rappresentata dalla combinazione fludarabina (F), ciclofosfamide (C) e rituximab (R), secondo lo schema FCR (Keating MJ, 2005; Hallek M et al, 2010), in quanto questo trattamento ha per la prima volta documentato un allungamento della sopravvivenza rispetto al migliore standard, rappresentato dalla combinazione FC, che a sua volta si era dimostrata superiore a F e a C in precedenti studi, riassunti in Tabella XII. Questa è la terapia di scelta nei pazienti con IGHV mutato.

Invece è da preferire ibrutinib nei pazienti con profilo IGHV “non-mutato”, alla luce dei risultati del trial clinico randomizzato che ne ha documentato la capacità di produrre un netto vantaggio di PFS rispetto a FCR (Shanafelt T et al, 2018). In questo trial randomizzato è stato registrato un vantaggio di sopravvivenza nel braccio ibrutinib e rituximab in tutta la popolazione dello studio, con un vantaggio di sopravvivenza libera da progressione (PFS) significativo limitatamente al gruppo con IGHV non mutato (Shanafelt T et al, 2018). L’obiettivo del trattamento nel giovane deve essere, quando possibile, l’ottenimento della remissione completa secondo i criteri clinici NCI (Hallek M, 2008), obiettivo raggiungibile con lo schema FCR in un 44-70% dei casi (Keating MJ, 2005; Hallek M, 2010b). I pazienti trattati con FCR nel trial CLL8 presentavano una sopravvivenza libera da progressione pari al 38% e una sopravvivenza pari al 69,4% dopo una mediana di osservazione di 5,9 anni (Fischer K, 2012a). I pazienti con caratteristiche genetiche favorevoli (IGHV mutato e assenza di 11q- e 17p-) possono ottenere risposte durature in circa i 2/3 dei casi  (Fischer K, 2016; Rossi D, 2015; Thompson PA, 2016). La terapia FCR richiede uno stretto monitoraggio ematologico e, di norma, profilassi antinfettiva e antivirale. In caso di neutropenia o tossicità ematologica al momento della ripresa terapeutica è obbligatoria la riduzione della dose del 20%, anche ripetuta in caso di ulteriore successiva citopenia. Si consideri che nei due principali studi che hanno descritto l’efficacia di FCR (Keating MJ et al, 2005; Hallek M et al, 2010):

– l’età mediana dei pazienti era di 58-61 anni, con 11-13% di pazienti >70 anni;
– il 74% dei pazienti ha completato la terapia con i previsti 6 cicli nei succitati studi;
– non è stata documentato vantaggio di sopravvivenza nei pazienti > 70 anni (Hallek M et al, 2010);
– si sono osservate neutropenie tardive nell’anno seguente la sospensione del trattamento nel 10-20% dei pazienti, con infezioni nel 10% dei pazienti (Strati P et al, 2013);
– in uno studio con lungo follow-up condotto all’MDACC (Benjamini O et al, 2015), l’incidenza di mielodisplasia o leucemia secondaria era pari al 5,1%.

La combinazione bendamustina e rituximab si è dimostrata efficace e relativamente maneggevole (Fischer K et al, 2012). Questa combinazione ha ottenuto un 31,5% di risposte complete (RC) con una PFS di 43,2 mesi e oggi può rappresentare una valida alternativa a FCR, limitatamente al paziente meno giovane o anziano in buone condizioni con IGHV mutato (Eichhorst B et al, 2016).

 

b) Pazienti con comorbidità

 

Nei pazienti anziani e in presenza di comorbidità, il clorambucile associato agli anticorpi monoconali anti CD20 rappresenta un’opzione terapeutica nei pazienti senza delezione 17p-/mutazione di TP53 e con IGHV mutato. La sua associazione con rituximab ha prodotto risposte complete nell’8-19% dei casi, con una PFS di 15-34 mesi, con tossicità limitata. Il clorambucile con il nuovo anticorpo anti CD20 obinutuzumab ha consentito di ottenere risposte complete nel 22% dei casi con negativizzazione della malattia minima residua in oltre il 20% dei casi, dimostrandosi significativamente più efficace della combinazione clorambucile e rituximab in termini di profondità della risposta con negativizzazione della malattia minima residua e di PFS, con un tempo al successivo trattamento di 42,7 mesi (Goede Vet al, 2015). Con un più lungo follow-up è stato riportato un vantaggio di sopravvivenza a favore di clorambucile e obinutuzumab rispetto a clorambucile e rituximab (Goede V et al, 2018).

Nei pazienti anziani non pre-trattati ibrutinib ha dimostrato grande efficacia e buona tollerabilità. Questa terapia si è dimostrata superiore rispetto alle combinazioni di chemioimmunoterapia nel paziente anziano con IGHV non mutato ed è pertanto raccomandata in questi casi.

Mentre la terapia orale con ibrutinib deve essere somministrata sino a progressione, la combinazione di durata definita (12 mesi) venetoclax + obinutuzumab, approvata da EMA e al momento non ancora utilizzabile in Italia nei pazienti in prima linea, produce analogo vantaggio rispetto alla chemioimmunoterapia e rappresenterà quindi un’importante opzione per i pazienti con profilo genetica sfavorevole (Fischer K et al, 2019).

 

c) Terapia di prima linea nei pazienti con delezione 17p o mutazioni di TP53

 

Nei pazienti con 17p- o con mutazione di TP53 l’approccio terapeutico moderno prevede l’utilizzo di ibrutinib, venetoclax o idelalisib e rituximab (Hallek M et al, 2017). Infatti i dati storici con i regimi chemioimmunoterapici appaiono decisamente insoddisfacenti in questo sottogruppo della LLC. Il classico FCR migliora la sopravvivenza libera da progressione rispetto a FC, ma solo il 18% dei pazienti risultava libero da progressione a 3 anni in uno studio (Hallek M et al, 2010). Il trattamento con alemtuzumab, associato o meno a desametazone o a metilprednisone ad alte dosi, ha dimostrato efficacia in questi pazienti, che tuttavia vanno incontro a progressione in tempi relativamente rapidi con una PFS mediana di 18 mesi in uno studio (Pettitt AR et al, 2012). La gestione degli eventi avversi, in particolare delle problematiche infettive, ha sempre limitato l’uso di questa terapia a centri esperti e alemtuzumab non è oggi più in commercio per questa indicazione. Discreta è anche risultata l’efficacia e la tolleranza della combinazione fludarabina e alemtuzumab in prima linea nei pazienti ad alto rischio (Mauro FR et al, 2014).  Il trapianto di midollo è un’opzione da considerare in questi pazienti secondo raccomandazioni condivise dalla comunità scientifica (Dreger P et al, 2014).

Risultati decisamente incoraggianti sono stati invece descritti nei trial che impiegavano le terapie target con ibrutinib, idelalisib e rituximab o venetoclax. In questi studi sono state descritte risposte obiettive:

– nel 97% di 33 pazienti trattati con ibrutinib, che evidenziavano pochissimi eventi di progressione ad una mediana di osservazione di 24 mesi (Farooqui MZ et al, 2015);
– in tutti i 9 pazienti trattati con idelalisib e rituximab, in assenza di progressione (O’Brien SM et al, 2015).

Questi risultati indicano come questi farmaci che interferiscono con il segnale del BCR possano rappresentare oggi l’opzione terapeutica di scelta per questo sottogruppo citogenetico di pazienti (O’Brien S et al, 2014).

Gli ottimi risultati dimostrati da venetoclax nei pazienti recidivati o refrattari con 17p- (si veda la tabella XV) (Stilgenbauer S et al, 2016) hanno portato all’indicazione all’impiego in prima linea di questa molecola nei pazienti che hanno fallito ibrutinib o in caso di controindicazioni all’impiego di un inibitore del BCR. Quindi, nella pratica clinica odierna, pur considerando che il follow-up è ancora breve e che i dati di sicurezza nel medio periodo non sono stati ancora pienamente definiti (vide infra), la terapia di prima linea di questo sottotipo altamente sfavorevole di LLC si deve avvalere di ibrutinib o, nel caso questo risulti controindicato, di venetoclax o di idelalisib e rituximab.

Le principali opzioni di terapia di prima linea sono riassunte in Figura VIII.

 

 

 

 

 

 

Figura VIII: Principali opzioni per la Terapia di prima linea nel paziente con LLC nel 2020.

 

 

 

Terapia dei pazienti con LLC recidivata o refrattaria

 

L’efficacia e la tollerabilità dei regimi di più comune impiego nel paziente recidivato o refrattario sono riassunte in Tabella XIII, mentre i risultati ottenuti con i farmaci biologici ibrutinib, idelalisib + rituximab e venetoclax (ABT-199) sono riassunti in Tabella XIV.

a) Di grandissimo interesse è la dimostrazione di una elevata percentuale di risposte con un 75% di PFS a 26 mesi ottenuta nella LLC recidivata o refrattaria con l’inibitore della BTK ibrutinib (Byrd JC et al, 2013), che agisce interferendo con il BCR signaling e le interazioni con il microambiente, mobilizzando i linfociti dalle sedi linfonodali coinvolte e inducendone l’apoptosi (Ten Hacken E et al, 2015). A 5 anni, la PFS mediana nella popolazione totale era di 51 mesi, nella popolazione con IGHV non mutato era di 43 mesi e nella popolazione con 17p- di 26 mesi (O’Brien S et al, 2018). Ibrutinib si è dimostrato in grado di prolungare la PFS e la sopravvivenza globale (OS) rispetto ad ofatumumab nella LLC recidivata o refrattaria (Byrd JC et al, 2019). Il farmaco, in genere ben tollerato, produce frequentemente una linfocitosi periferica, anche marcata, che quasi sempre regredisce in alcuni mesi e che non pregiudica l’efficacia del trattamento.

b) La pubblicazione di dati che documentano la superiorità di idelalisib e rituximab rispetto al solo rituximab in termini di PFS e OS in una popolazione ad alto rischio per caratteristiche cliniche (numerose precedenti linee di trattamento, età avanzata, comorbidità) e biologiche (alta percentuale di pazienti con delezione 17p e/o 11q-) (Sharman JP et al, 2019) rende questa combinazione. A causa della sua scarsa tolleranza legata all’emergenza di eventi avversi immuno-mediati (vide infra) questa terapia deve essere riservata a pazienti che non possono essere avviati a terapia con ibrutinib e a venetoclax.

c) Venetoclax ha prodotto risposte nel 79% dei casi in pazienti ad alto rischio (17p-) e pluritrattati, con un 20% di risposte complete e 5% di negativizzazione della malattia minima residua ed una PFS pari al 69% a 15 mesi (Roberts AW et al, 2015). Nello studio dedicato ai pazienti con delezione 17p (Stilgenbauer S et al, 2018), la percentuale di risposte (77%) e la PFS stimata a 24 mesi pari al 54% rappresentano un ottimo risultato.
Nel trial che ha paragonato venetoclax e rituximab (VR) per un periodo di 2 anni con la combinazione classica ed ampiamente utilizzata bendamustina e rituxmab (BR) sono emersi alcuni aspetti importanti (Seymour JF et al, 2018; Kater AP et al, 2019):

• VR migliora la sopravvivenza e la PFS rispetto a BR;
• VR ottiene risposte con negativizzazione della malattia minima residua nella maggior parte di pazienti già a partire dal 9 mese;
• Il 67% dei pazienti ha terminato i due anni previsti di trattamento e ha sospeso come da protocollo la terapia. Dopo una mediana di 9,9 mesi dalla sospensione di VR, solo il 12% dei pazienti ha mostrato progressione e l’aggiornamento del follow-up del 2019 ha dimostrato che un 68% dei 130 pazienti che aveva completato i primi due anni di terapia era libero da progressione dopo un follow-up mediano dalla sospensione di 24 mesi.

Oltre alla neutropenia e le infezioni, osservate con qualunque terapia della LLC, tra le tossicità specifiche di questi farmaci occorre considerare con attenzione:

a) la fibrillazione atriale e l’ipertensione arteriosa, oltre ai sanguinamenti e la diarrea, quasi sempre di grado lieve, per ibrutinib (Byrd JC et al, 2015);
b) fenomeni su base infiammatoria e/o disimmune per idelalisib, quali diarrea e/o colite anche ad insorgenza tardiva, polmonite interstiziale anche di grado severo, infezioni polmonari da Pneumocystis jirovecii e/o da Cytomegalovirus e aumento delle transaminasi (Louie CY et al, 2015; Coutré SE et al, 2015). La terapia di profilassi con cotrimoxazolo e trimetoprim è obbligatoria, al pari del monitoraggio della viremia da Cytomegalovirus;
c) la sindrome da lisi tumorale con venetoclax, che richiede misure preventive e attento monitoraggio.

Di fatto, questi agenti orali molto efficaci rappresentano oggi il trattamento di scelta nei pazienti refrattari e plurirecidivati, mentre gli schemi tradizionali di chemioimmunoterapia possono trovare uno spazio solo nei pazienti che hanno avuto una risposta prolungata alla terapia di prima linea (Cuneo A et al, 2018).  Qualora ci si orienti verso l’impiego della chemioimmunoterapia per la terapia di seconda linea occorre considerare che si può ritenere ragionevole proporre la ripetizione di un trattamento chemioimmunoterapico qualora la durata della remissione sia di almeno 36 mesi (Eichhorst 2019; Tam CS, 2014).

Qualora si opti per una chemioimmunoterapia nel paziente recidivato è bene ricordare che:

• Bendamustina e rituximab si sono dimostrati efficaci e relativamente ben tollerati, anche in pazienti pretrattati con regimi contenenti fludarabina (Fischer K et al, 2011).
• Ofatumumab ha dimostrato discreta efficacia e buona tolleranza ed è approvato per l’uso clinico in Europa nei pazienti refrattari a fludarabina e alemtuzumab. Analoga efficacia è stata dimostrata nei pazienti refrattari a fludarabina con malattia bulky (Wierda WG et al, 2010). L’associazione bendamustina e ofatumumab si è dimostrata efficace e ben tollerata in uno studio (Cortelezzi A et al, 2014).
• Le alte dosi di metilprednisolone in associazione a rituximab hanno mostrato una discreta efficacia in pazienti pretrattati con delezione 17p (Castro JE et al, 2009).

Infine, la lenalidomide, in associazione a rituximab, ha dimostrato efficacia e buona tollerabilità (Badoux XC et al, 2013). Questo trattamento non è registrato per l’uso clinico.

Il trapianto di midollo osseo allogenico ha dimostrato di poter indurre risposte cliniche prolungate (Dreger P et al, 2010), con progressiva negativizzazione del residuo leucemico in una parte dei casi grazie all’effetto immunomediato (Sorror ML et al, 2008). La sopravvivenza a 5 anni è di circa il 50% e la non-relapse mortality del 20% circa. La tossicità si manifesta con graft versus host disease (GVHD) acuta di grado ≥2 nel 50% circa dei casi e con GVHD cronica estesa nel 50% circa dei casi, sia nei pazienti trapiantati da fratelli HLA identici che da donatori non famigliari HLA-identici, con durata mediana della GVHD di 25 mesi (Sorror ML et al, 2008).

L’opzione trapiantologica deve essere presa in considerazione e discussa nei pazienti resistenti o recidivati che hanno risposto a ibrutinib o idelalisib o venetoclax in alternativa alla prosecuzione della terapia, specialmente in caso di presenza di delezione 17p/mutazioni di TP53 (Dreger P et al, 2014). Candidati a un approccio trapiantologico sono i pazienti giovani e in buone condizioni che non abbiano risposto o che siano progrediti dopo terapia con inibitori del BCR signaling o con venetoclax (Dreger P et al, 2018).

Le principali opzioni di terapia della LLC recidivata/refrattaria sono riassunte in Figura IX.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura IX. Principali opzioni di terapia della LLC recidivata/refrattaria nel 2020.

 

 

 

Nuove terapie di combinazione

 

I miglioramenti della sopravvivenza della LLC ottenuti grazie alle nuove terapie, che consentono di ottenere risposte profonde con negativizzazione della malattia minima residua (MMR), hanno generato una serie di studi che hanno testato l’efficacia e la sicurezza di terapie di combinazione per periodi di trattamento definiti, finalizzate all’eradicazione della malattia.

La combinazione che associa venetoclax a partire dal terzo ciclo di ibrutinib in 80 pazienti non precedentemente trattati  e ad alto rischio (i.e. con 17p-, 11q-, IGHV non mutato o di età ≥65 anni) ha prodotto remissioni complete nell’88% dopo 12 cicli di terapia di combinazione, con eradicazione della MMR a livello midollare nel 61% dei pazienti (Jain N et al, 2019).

E’ stata testata la combinazione ibrutinib e FCR (6 cicli) in 85 pazienti di età <65 anni, con sospensione di ibrutinib dopo 2 anni nei pazienti che ottenevano una risposta clinica e MMR negativa. Una negativizzazione della MMR a livello midollare veniva ottenuta in 71 (84%) pazienti. Un terzo dei pazienti trattati otteneva una risposta completa clinica con MMR negativa, rispetto ad un valore storico con FCR da solo su analoghi pazienti pari al 20% (p=0,0035) (Davids MS et al, 2019). Queste terapie non sono utilizzabili al di fuori di trial clinici.

 

 

 

BIBLIOGRAFIA

 

• Agbay RL, Jain N, Loghavi S, Medeiros LJ, Khoury JD. Histological transformation of chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma. Am J Hematol. 2016;91(10):1036-43.
• Andersen MA, Moser CE, Lundgren J, Niemann CU. Epidemiology of bloodstream infections in patients with chronic lymphocytic leukemia: a longitudinal nation-wide cohort study. Leukemia. 2019 Mar;33(3):662-670.
• Anderson MA, Tam C, Lew TE, Juneja S, Juneja M, Westerman D, Wall M, Lade S, Gorelik A, Huang DCS, Seymour JF, Roberts AW. Clinicopathological features and outcomes of progression of CLL on the BCL2 inhibitor venetoclax. Blood. 2017 Jun 22;129(25):3362-3370
• Austen B, Skowronska A, Baker C, Powell JE, Gardiner A, Oscier D, et al. Mutation status of the residual ATM allele is an important determinant of the cellular response to chemotherapy and survival in patients with chronic lymphocytic leukemia containing an 11q deletion. J Clin Oncol 2007;25:5448-57.
• Badoux XC, Keating MJ, Wang X, O’Brien SM, Ferrajoli A, Faderl S, Burger J, Koller C, Lerner S, Kantarjian H, Wierda WG. Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab chemoimmunotherapy is highly effective treatment for relapsed patients with CLL. Blood. 2011a Mar 17;117(11):3016-3024
• Badoux XC, Keating MJ, Wang X, O’Brien SM, Ferrajoli A, Faderl S, Burger J, Koller C, Lerner S, Kantarjian H, Wierda WG. Cyclophosphamide, fludarabine, alemtuzumab, and rituximab as salvage therapy for heavily pretreated patients with chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2011b Aug 25;118(8):2085-2093
• Bagnara D, Kaufman MS, Calissano C, Marsilio S, Patten PE, Simone R, Chum P, Yan XJ, Allen SL, Kolitz JE, Baskar S, Rader C, Mellstedt H, Rabbani H, Lee A, Gregersen PK, Rai KR, Chiorazzi N. A novel adoptive transfer model of chronic lymphocytic leukemia suggests a key role for T lymphocytes in the disease. Blood. 2011 May 19;117(20):5463-72.
• Balatti V, Bottoni A, Palamarchuk A, Alder H, Rassenti LZ, Kipps TJ, Pekarsky Y, Croce CM. NOTCH1 mutations in CLL associated with trisomy 12. Blood. 2012;119:329-31.
• Balatti V, Pekarky Y, Croce CM. Roleof microRNA in chronic lymphocytic leukemia onset and progression. J Hematol Oncol. 2015 Feb 20;8:12.
• Baliakas P, Iskas M, Gardiner A, Davis Z, Plevova K, Nguyen-Khac F, Malcikova J, Anagnostopoulos A, Glide S, Mould S, Stepanovska K, Brejcha M, Belessi C, Davi F, Pospisilova S, Athanasiadou A, Stamatopoulos K, Oscier D. Chromosomal translocations and karyotype complexity in chronic lymphocytic leukemia: a systematic reappraisal of classic cytogenetic data. Am J Hematol. 2014 Mar;89(3):249-255.
• Baron M, Zini JM, Challan Belval T, et al. Fungal infections in patients treated with ibrutinib: two unusual cases of invasive aspergillosis and cryptococcal meningoencephalitis. Leuk Lymphoma. 2017;58:2981-2.
• Benjamini O, Jain P, Trinh L, et al. Second cancers in patients with Chronic Lymphocytic Leukemia who received frontline FCR therapy – Distribution and clinical outcomes. Leuk Lymphoma. 2015; 56(6): 1643–1650
• Berger AH, Knudson AG, Pandolfi PP et al. A continuum model for tumour suppression. Nature. 2011, 476:163-169.
• Bichi R, Shinton SA, Martin ES, Koval A, Calin GA, Cesari R et al. Human chronic lymphocytic leukemia modeled in mouse by targeted TCL1 expression. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99:6955-60.
• Bottoni A, Calin GA. MicroRNAs as main players in the pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia. Microrna. 2014;2(3):158-64.
• Bottoni A,Rizzotto L, Lai TH, Liu C, Smith LL, Mantel R, Reiff S, El-Gamal D, Larkin K, Johnson AJ, Lapalombella R, Lehman A, Plunkett W, Byrd JC, Blachly JS, Woyach JA, Sampath D. Targeting BTK through microRNA in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016 Oct 17. pii: blood-2016-07-727750. [Epub ahead of print]
• Brown JR. How I treat CLL patients with ibrutinib. Blood. 2018;131:379-86.
• Buhl AM, Jurlander J, Jørgensen FS, Ottesen AM, Cowland JB, Gjerdrum LM et al. Identification of a gene on chromosome 12q22 uniquely overexpressed in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2006; 107:2904-11.
• Burger I et al. Ibrutinib as Initial Therapy for Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 2015; 373: 2425-37.
• Burger JA, Burger M, Kipps TJ. Chronic lymphocytic leukemia B cells express functional CXCR4 chemokine receptors that mediate spontaneous migration beneath bone marrow stromal cells. Blood. 1999; 94: 3658-67.
• Burger JA. Nurture versus nature: the microenvironment in chronic lymphocytic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program; 2011:96-103.
• Byrd JC, Furman RR, Coutre SE, Burger JA, Blum KA, Coleman M et al. Three-year follow-up of treatment-naïve and previously treated patients with CLL and SLL receiving single-agent ibrutinib. Blood. 2015, 125:2497-2506.
• Byrd JC, Furman RR, Coutre SE, Flinn IW, Burger JA, Blum KA et al. Targeting BTK with ibrutinib in relapsed chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2013, 369:32-42.
• Byrd JC, Hillmen P, O’Brien S, Barrientos JC, Reddy NM, Coutre S, Tam CS, Mulligan SP, Jaeger U, Barr PM, Furman RR, Kipps TJ, Thornton P, Moreno C, Montillo M, Pagel JM, Burger JA, Woyach JA, Dai S, Vezan R, James DF, Brown JR. Long-term follow-up of the RESONATE phase 3 trial of ibrutinib vs ofatumumab. Blood. 2019 May 9;133(19):2031-2042. doi: 10.1182/blood-2018-08-870238.
• Caligaris-Cappio F, Ghia P. Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease? J Clin Oncol. 2008; 26:4497-503.
• Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, Bichi R, Zupo S, Noch E et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002; 99:15524-9.
• Calissano C, Damle RN, Hayes G, Murphy EJ, Hellerstein MK, Moreno C et al. In vivo intraclonal and interclonal kinetic heterogeneity in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2009; 114:4832-42.
• Callea V, Brugiatelli M, Stelitano C, et al. Incidence of second neoplasia in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia treated with chlorambucil maintenance chemotherapy. Leuk Lymphoma. 2006; 47:2314–2320.
• Castoldi G, Liso V. Malattie del sangue e degli organi ematopoietici, 6 ed. Mc Grow Hill, Milano, 2013, p 402-418.
• Catovsky D, Richards S, Matutes E, Oscier D, Dyer MJ, Bezares RF et al. Assessment of fludarabine plus cyclophosphamide for patients with chronic lymphocytic leukaemia (the LRF CLL4 Trial): a randomised controlled trial. Lancet. 2007; 370:230-9.
• Chamilos G, Lionakis MS, Kontoyiannis DP. Call for Action: Invasive Fungal Infections Associated With Ibrutinib and Other Small Molecule Kinase Inhibitors Targeting Immune Signaling Pathways. Clin Infect Dis. 2018;66:140-8.
• Chen L, Widhopf G, Huynh L, Rassenti L, Rai KR, Weiss A et al. Expression of ZAP-70 is associated with increased B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2002; 100:4609-14.
• Cheson BD, Vena DA, Barrett J, et al. Second malignancies as a consequence of nucleoside analog therapy for chronic lymphoid leukemias. J Clin Oncol. 1999; 17:2454-60
• Chu CC, Catera R, Zhang L, Didier S, Agagnina BM, Damle RN et al. Many chronic lymphocytic leukemia antibodies recognize apoptotic cells with exposed nonmuscle myosin heavy chain IIA: implications for patient outcome and cell of origin. Blood. 2010; 115:3907-15.
• Chu P, Deforce D, Pedersen IM, Kim Y, Kitada S, Reed JC et al. Latent sensitivity to Fas-mediated apoptosis after CD40 ligation may explain activity of CD154 gene therapy in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99:3854-9.
• Cramer P, Langerbeins P, Eichhorst B, Hallek M. Advances in first-line treatment of chronic lymphocytic leukemia: current recommendations on management and first-line treatment by the German CLL Study Group (GCLLSG). Eur J Haematol. 2016, 96:9-18.
• Cuneo A, Bigoni R, Rigolin GM, Roberti MG, Bardi A, Cavazzini F et al. Late appearance of the 11q22.3-23.1 deletion involving the ATM locus in B-cell chronic lymphocytic leukemia and related disorders. Clinico-biological significance. Haematologica. 2002; 87:44-51.
• Cuneo A, Follows G, Rigolin GM, Piciocchi A, Tedeschi A, Trentin L, Perez AM, Coscia M, Laurenti L, Musuraca G, Farina L, Delgado AR, Orlandi EM, Galieni P, Mauro FR, Visco C, Amendola A, Billio A, Marasca R, Chiarenza A, Meneghini V, Ilariucci F, Marchetti M, Molica S, Re F, Gaidano G, Gonzalez M, Forconi F, Ciolli S, Cortelezzi A, Montillo M, Smolej L, Schuh A, Eyre TA, Kennedy B, Bowles KM, Vignetti M, de la Serna J, Moreno C, Foà R, Ghia P; GIMEMA, European Research Initiative on CLL (ERIC) and UK CLL forum. Efficacy of bendamustine and rituximab as first salvage treatment in chronic lymphocytic leukemia and indirect comparison with ibrutinib: a GIMEMA, ERIC and UK CLL FORUM study. Haematologica. 2018 Jul;103(7):1209-1217.
• Cuneo A, Barosi G, Danesi R, Fagiuoli S, Ghia P, Marzano A, Montillo M, Poletti V, Viale P, Zinzani PL Management of adverse events associated with idelalisib treatment in chronic lymphocytic leukemia and follicular lymphoma: a multidisciplinary position paper. Hematol Oncol. 2019 Feb;37(1):3-14.
• Dal Bo M, Rossi FM, Rossi D, Deambrogi C, Bertoni F, Del Giudice I et al. 13q14 deletion size and number of deleted cells both influence prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 2011 Aug;50(8):633-43
• Damle RN, Batliwalla FM, Ghiotto F, Valetto A, Albesiano E, Sison C et al. Telomere length and telomerase activity delineate distinctive replicative features of the B-CLL subgroups defined by immunoglobulin V gene mutations. Blood. 2004; 103:375-82.
• Darzentas N, Hadzidimitriou A, Murray F, Hatzi K, Josefsson P, Laoutaris N et al. A different ontogenesis for chronic lymphocytic leukemia cases carrying stereotyped antigen receptors: molecular and computational evidence. Leukemia. 2010; 24:125-32.
• Davids MS, Brander DM, Kim HT, Tyekucheva S, Bsat J, Savell A, Hellman JM, Bazemore J, Francoeur K, Alencar A, Shune L, Omaira M, Jacobson CA, Armand P, Ng S, Crombie J, LaCasce AS, Arnason J, Hochberg EP, Takvorian RW, Abramson JS, Fisher DC, Brown JR; Blood Cancer Research Partnership of the Leukemia & Lymphoma Society. Ibrutinib plus fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab as initial treatment for younger patients with chronic lymphocytic leukaemia: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Haematol. 2019 Aug;6(8):e419-e428. doi: 10.1016/S2352-3026(19)30104-8.
• de Weerdt I, Koopmans SM, Kater AP, Gelder M. Incidence and management of toxicity associated with ibrutinib and idelalisib: a practical approach. Haematologica. 2017; Epub ahead of print on August 3, 2017, as doi:10.3324/haematol.2017.164103.
• Del Giudice I, Rossi D, Chiaretti S, Marinelli M, Tavolaro S, Gabrielli S, Laurenti L, Marasca R, Rasi S, Fangazio M, Guarini A, Gaidano G, Foà R. NOTCH1 mutations in +12 chronic lymphocytic leukemia (CLL) confer an unfavorable prognosis, induce a distinctive transcriptional profiling and refine the intermediate prognosis of +12 CLL. Haematologica. 2012;97:437-41.
• Del Giudice I,Marinelli M, Wang J, Bonina S, Messina M, Chiaretti S, Ilari C, Cafforio L, Raponi S, Mauro FR, Di Maio V, De Propris MS, Nanni M, Ciardullo C, Rossi D, Gaidano G, Guarini A, Rabadan R, Foà R. Inter- and intra-patient clonal and subclonal heterogeneity of chronic lymphocytic leukaemia: evidences from circulating and lymph nodal compartments. Br J Haematol. 2016 Feb;172(3):371-83.
• Dewald GW, Brockman SR, Paternoster SF, Bone ND, O’Fallon JR, Allmer C, et al. Chromosome anomalies detected by interphase fluorescence in situ hybridization: correlation with significant biological features of B-cell chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol.2003 Apr;121(2):287-95.
• Dohner H, Fischer K, Bentz M, Hansen K, Benner A, Cabot G et al. p53 gene deletion predicts for poor survival and non-response to therapy with purine analogs in chronic B-cell leukemias. Blood. 1995, 85:1580-1589.
• Döhner H, Stilgenbauer S, James MR, Benner A, Weilguni T, Bentz M et al. 11q deletions identify a new subset of B-cell chronic lymphocytic leukemia characterized by extensive nodal involvement and inferior prognosis. Blood. 1997; 89:2516-22.
• Dreger P, et al. Managing high-risk CLL during transition to a new treatment era: stem cell transplantation or novel agents? Blood. 2014; 124:3841-9.
• Dreger P, Ghia P, Schetelig J, van Gelder M, Kimby E, Michallet M, Moreno C, Robak T, Stilgenbauer S, Montserrat E; European Research Initiative on CLL (ERIC) and the European Society for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). High-risk chronic lymphocytic leukemia in the era of pathway inhibitors: integrating molecular and cellular therapies. Blood. 2018 Aug 30;132(9):892-902.
• Dühren-von Minden M, Übelhart R, Schneider D, Wossning T, Bach MP, Buchner M, Hofmann D, Surova E, Follo M, Köhler F, Wardemann H, Zirlik K, Veelken H, Jumaa H. Chronic lymphocytic leukaemia is driven by antigen-independent cell-autonomous signalling. Nature. 2012 Sep 13;489(7415):309-12.
• Efanov A, Zanesi N, Nazaryan N, Santanam U, Palamarchuk A, Croce CM et al. CD5+CD23+ leukemic cell populations in TCL1 transgenic mice show significantly increased proliferation and Akt phosphorylation. Leukemia. 2010; 24:970-5.
• Eichhorst B, Fink AM, Bahlo J, Busch R, Kovacs G, Maurer C et al. First-line chemoimmunotherapy with bendamustine and rituximab versus fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab in patients with advanced chronic lymphocytic leukaemia (CLL10): an international, open-label, randomised, phase 3, non-inferiority trial. Lancet Oncol. 2016 May 20 epub ahead of print
• Eichhorst B, Hallek M. Guidelines for Diagnosis, Indications for Treatment, Response Assessment, and Supportive Management of Chronic Lymphocytic Leukemia: The 2018 Update. In: Hallek M, Eichhorst B, Catovsky D (eds). Chronic Lymphocytic Leukemia. Hematologic Malignancies. Springer, Cham. 2019.
• Fabbri G, Dalla-Favera R. Themolecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nat Rev Cancer. 2016 Mar;16(3):145-62.
• Fabbri G, Rasi S, Rossi D, Trifonov V, Khiabanian H, Ma J, et al. Analysis of the chronic lymphocytic leukemia coding genome: role of NOTCH1 mutational activation. J Exp Med. 2011;208:1389-401.
• Fegan C, Robinson H, Thompson P, Whittaker JA, White D. Karyotypic evolution in CLL: identification of a new sub-group of patients with deletions of 11q and advanced or progressive disease. Leukemia. 1995; 9(12):2003-8.
• Fischer K, Al-Sawaf O, Bahlo J, Fink AM, Tandon M, Dixon M, Robrecht S, Warburton S, Humphrey K, Samoylova O, Liberati AM, Pinilla-Ibarz J, Opat S, Sivcheva L, Le Dû K, Fogliatto LM, Niemann CU, Weinkove R, Robinson S, Kipps TJ, Boettcher S, Tausch E, Humerickhouse R, Eichhorst B, Wendtner CM, Langerak AW, Kreuzer KA, Ritgen M, Goede V, Stilgenbauer S, Mobasher M, Hallek M. Venetoclax and Obinutuzumab in Patients with CLL and Coexisting Conditions. N Engl J Med. 2019 Jun 6;380(23):2225-2236. doi: 10.1056/NEJMoa1815281
• Fischer K, Bahlo J, Fink AM, et al. Long-term remissions after FCR chemoimmunotherapy in previously untreated patients with CLL: updated results of the CLL8 trial. Blood 2015 2015-06- 651125
• Foà R Del Giudice I, Guarini A, Rossi D, Gaidano G; Clinical implications of the molecular genetics of chronic lymphocytic leukemia; Haematologica 2013; 98:675-85.
• Foà R, Guarini A. A mechanism-driven treatment for chronic lymphocytic leukemia? N Engl J Med. 2013;369:85-7
• Freeman JA, Crassini KR, Best OG, et al. Immunoglobulin G subclass deficiency and infection risk in 150 patients with chronic lymphocytic leukemia. Leukemia & lymphoma 2013;54:99-104.
• Friman V, Winqvist O, Blimark C, Langerbeins P, Chapel H, Dhalla F. Secondary immunodeficiency in lymphoproliferative malignancies. Hematol Oncol. 2016 Sep;34(3):121-32.
• Fülop Z, Csernus B, Tímár B, Szepesi A, Matolcsy A. Microsatellite instability and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter’s transformation of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2003;17:411-5.
• Garg R, Wierda W, Ferrajoli A, Abruzzo L, Pierce S, Lerner S et al. The prognostic difference of monoallelic versus biallelic deletion of 13q in chronic lymphocytic leukemia. Cancer. 2012 Jul 15;118(14):3531-7.
• Ghia P, Caligaris-Cappio F. The indispensable role of microenvironment in the natural history of low-grade B-cell neoplasms. Adv Cancer Res. 2000; 79:157-73.
• Ghia P, Cuneo A. Ibrutinib in the real world patient: many lights and some shades. Haematologica. 2016;101:1448-1450
• Ghiotto F, Fais F, Valetto A, Albesiano E, Hashimoto S, Dono M et al. Remarkably similar antigen receptors among a subset of patients with chronic lymphocytic leukemia. J Clin Invest. 2004; 113:1008-16.
• Giridhar KV, Shanafelt T, Tosh PK et al. Disseminated herpes zoster in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients treated with B-cell receptor pathway inhibitors. Leukemia & Lymphoma. 2016. DOI:10.1080/10428194.2016.1267352
• Girschik J, Fritschi L, Threlfall T, et al: Deaths from non-melanoma skin cancer in Western Australia. Cancer Causes Control. 2008; 19:879-885
• Goede V et al; EHA 2018 abs S151 https://learningcenter.ehaweb.org/eha/2018/stockholm/215923/
• Goldin LR, Slager SL. Familial CLL: genes and environment. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:339-45.
• Gonzalez D, Martinez P, Wade R, Hockley S, Oscier D, Matutes E et al. Mutational status of the TP53 gene as a predictor of response and survival in patients with chronic lymphocytic leukemia: results from the LRF CLL4 trial. J Clin Oncol. 2011, 29:2223-2229.
• Grabowski P, Hultdin M, Karlsson K, Tobin G, Aleskog A, Thunberg U et al. Telomere length as a prognostic parameter in chronic lymphocytic leukemia with special reference to VH gene mutation status. Blood. 2005; 105:4807-12.
• Greene MH, Hoover RN, Fraumeni JF Jr. Subsequent cancer in patients with chronic lymphocytic leukemia–a possible immunologic mechanism. J Natl Cancer Inst. 1978; 61:337–34
• Grubor V, Krasnitz A, Troge JE, Meth JL, Lakshmi B, Kendall JT et al. Novel genomic alterations and clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia revealed by representational oligonucleotide microarray analysis (ROMA). Blood. 2009; 113:1294-303.
• Guarini A, Chiaretti S, Tavolaro S, Maggio R, Peragine N, Citarella F et al. BCR ligation induced by IgM stimulation results in gene expression and functional changes only in IgV H unmutated chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells. Blood. 2008; 112:782-92.
• Gurrieri C, McGuire P, Zan H, Yan XJ, Cerutti A, Albesiano E et al. Chronic lymphocytic leukemia B cells can undergo somatic hypermutation and intraclonal immunoglobulin V(H)DJ(H) gene diversification. J Exp Med. 2002; 196:629-639.
• Haferlach C, Dicker F, Schnittger S, Kern W, Haferlach T. Comprehensive genetic characterization of CLL: a study on 506 cases analysed with chromosome banding analysis, interphase FISH, IgV(H) status and immunophenotyping. Leukemia. 2007 Dec;21(12):2442-2451.
• Haferlach C, Dicker F, Weiss T, Schnittger S, Beck C, Grote-Metke A, Oruzio D, Kerm W, Haferlach T. Toward a comprehensive prognostic scoring system in chronic lymphocytic leukemia based on a combination of genetic parameters. Genes Chromosomes Cancer. 2010 Sep;49(9):851-859.
• Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 2008;111(12):5446
• Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, et al. iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL. Blood. 2018;131:2745-60.
• Hallek M, Fischer K, Fingerle-Rowson G, Fink AM, Busch R, Mayer J et al for the International Group of Investigators; German Chronic Lymphocytic Leukaemia Study Group. Addition of rituximab to fludarabine and cyclophosphamide in patients with chronic lymphocytic leukaemia: a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 2010; 376:1164-74.
• Hallek M. Chronic lymphocytic leukemia: 2017 update on diagnosis, risk stratification, and treatment. Am J Hematol. 2017; 92:946-965
• Hallek M. Chronic lymphocytic leukemia: 2020 update on diagnosis, risk stratification and treatment. Am J Hematol. 2019;94(11):1266–1287. doi:10.1002/ajh.25595.
• Hallek M. Therapy of chronic lymphocytic leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol. 2010b; 23:85-96.
• Herling CD, Cymbalista F, Groß-Ophoff-Müller C, et al. Early treatment with FCR versus watch and wait in patients with stage Binet A high-risk chronic lymphocytic leukemia (CLL): a randomized phase 3 trial [published online ahead of print, 2020 Feb 18]. Leukemia. 2020;10.1038/s41375-020-0747-7.
• Herling CD, Klaumünzer M, Rocha CK, Altmüller J, Thiele H, Bahlo J, Kluth S, Crispatzu G, HerlingM, Schiller J, Engelke A, Tausch E, Döhner H, Fischer K, Goede V, Nürnberg P, Reinhardt HC, Stilgenbauer S, Hallek M, Kreuzer KA. Complex karyotypes and KRAS and POT1 mutations impact outcome in CLL after chlorambucil-based chemotherapy or chemoimmunotherapy. Blood. 2016 Jul 21;128(3):395-404.
• Herold T, Seiler T, Egensperger R, et al. Progressive multifocal leukoencephalopathy after treatment with rituximab, fludarabine and cyclophosphamide in a patient with chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymphoma. 2012;53:169-72.
• Hisada M, Biggar RJ, Greene MH, Fraumeni JF Jr, Travis LB. Solid tumors after chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2001;98(6):1979.
• Hoechstetter MA, et al. Early, risk-adapted treatment with fludarabine in Binet stage A chronic lymphocytic leukemia patients: results of the CLL1 trial of the German CLL study group. Leukemia. 2017 Aug 14. doi: 10.1038/leu.2017.246. [Epub ahead of print]
• Huang SJ, Gillan TL, Gerrie AS, Hrynchak M, Karsan A, Ramadan K et al. Influence of clone and deletion size on outcome in chronic lymphocytic leukemia patients with an isolated deletion 13q in a population-based analysis in British Columbia, Canada. Genes Chromosomes Cancer. 2016 Jan;55(1):16-24.
• Humby F, Bombardieri M, Manzo A, Kelly S, Blades MC, Kirkham B et al. Ectopic lymphoid structures support ongoing production of class-switched autoantibodies in rheumatoid synovium. PLoS Med. 2009; 6:e1.
• International CLL-IPI working group. An international prognostic index for patients with chronic lymphocytic leukaemia (CLL-IPI): a meta-analysis of individual patient data. Lancet Oncol 2016;17(6):779-9
• Iskierka-Jażdżewska E, Robak T. Minimizing and managing treatment-associated complications in patients with chronic lymphocytic leukemia. Expert Rev Hematol. 2019 Nov 30:1-15.
• Jain N, Keating M, Thompson P, Ferrajoli A, Burger J, Borthakur G, Takahashi K, Estrov Z, Fowler N, Kadia T, Konopleva M, Alvarado Y, Yilmaz M, DiNardo C, Bose P, Ohanian M, Pemmaraju N, Jabbour E, Sasaki K, Kanagal-Shamanna R, Patel K, Jorgensen J, Garg N, Wang X, Sondermann K, Cruz N, Wei C, Ayala A, Plunkett W, Kantarjian H, Gandhi V, Wierda W. Ibrutinib and Venetoclax for First-Line Treatment of CLL. N Engl J Med. 2019 May 30;380(22):2095-2103. doi: 10.1056/NEJMoa1900574
• Jain P, Keating M, Thompson PA, Trinh L, Wang X, Wierda W, et al. High fluorescence in situ hybridization percentage of deletion 11q in patients with chronic lymphocytic leukemia is an independent predictor of adverse outcome. Am J Hematol. 2015 Jun;90(6):471-7.
• Jennifer A, Woyach JA. Treatment with F+R Produces Extended OS and PFS in CLL without Increased Risk of Second Malignancy: Long-Term Follow up of CALGB Study 9712 (abstract). ASH 2009 Book of abstracts: Abs No. 539.
• Kater AP, Seymour JF, Hillmen P, Eichhorst B, Langerak AW, Owen C, Verdugo M, Wu J, Punnoose EA, Jiang Y, Wang J, Boyer M, Humphrey K, Mobasher M, Kipps TJ. Fixed Duration of Venetoclax-Rituximab in Relapsed/Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia Eradicates Minimal Residual Disease and Prolongs Survival: Post-Treatment Follow-Up of the MURANO Phase III Study. J Clin Oncol. 2019 Feb 1;37(4):269-277.
• Keating MJ, O’Brien S, Albitar M, Lerner S, Plunkett W, Giles F et al. Early results of a chemoimmunotherapy regimen of fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab as initial therapy for chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol. 2005; 23:4079-88.
• Kjellander C, Björkholm M, Källman O, Giske CG, Weibull CE, Löve TJ, Landgren O, Kristinsson SY. Bloodstream infections in patients with chronic lymphocytic leukemia: a longitudinal single-center study. Ann Hematol. 2016 May;95(6):871-9.
• Klein U, Lia M, Crespo M, Siegel R, Shen Q, Mo T et al. The DLEU2/miR-15a/16-1 cluster controls B cell proliferation and its deletion leads to chronic lymphocytic leukemia. Cancer Cell. 2010; 17:28-40.
• Klein U, Tu Y, Stolovitzky GA, Mattioli M, Cattoretti G, Husson H et al. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneous phenotype related to memory B cells. J Exp Med. 2001Dec 3;194(11):1625-38.
• Köhnke T, Wittmann VK, Bücklein VL, Lichtenegger F, Pasalic Z, Hiddemann W, Spiekermann K, Subklewe M. Diagnosis of CLL revisited: increased specificity by a modified five-marker scoring system including CD200. Br J Haematol. 2017 Nov;179(3):480-487. doi: 10.1111/bjh.14901. Epub 2017 Aug 18.
• Kreiniz N, Bejar J, Polliack A, Tadmor T. Severe pneumonia associated with ibrutinib monotherapy for CLL and lymphoma. Hematol Oncol. 2018;36:349-54.
• Landau DA, Tausch E, Taylor-Weiner AN, Stewart C, Reiter JG, Bahlo J, Kluth S, Bozic I, Lawrence M, Böttcher S, Carter SL, Cibulskis K, Mertens D, Sougnez CL, Rosenberg M, Hess JM, Edelmann J, Kless S, Kneba M, Ritgen M, Fink A, Fischer K, Gabriel S, Lander ES, Nowak MA, Döhner H, Hallek M, Neuberg D, Getz G, Stilgenbauer S, Wu CJ. Mutationsdriving CLL and their evolution in progression and relapse. Nature. 2015 Oct 22;526(7574):525-30.
• Lanham S, Hamblin T, Oscier D, Ibbotson R, Stevenson F, Packham G. Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2003; 101:1087-93.
• Le Bris Y, Struski S, Guièze R, Rouvellat C, Prade N, Troussard X, Tournilhac O, Béné MC, Delabesse E, Ysebaert L. Major prognostic value of complex karyotype in addition to TP53 and IGHV mutational status in first-line chronic lymphocytic leukemia. Hematol Oncol. 2016 Sep 28. [Epub ahead of print].
• Lin TT, Letsolo BT, Jones RE, Rowson J, Pratt G, Hewamana S et al. Telomere dysfunction and fusion during the progression of chronic lymphocytic leukaemia: evidence for a telomere crisis. Blood. 2010; 116:1899-907.
• Maffei R, Martinelli S, Santachiara R, Rossi D, Guarnotta C, Sozzi E et al. Angiopoietin-2 plasma dosage predicts time to first treatment and overall survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2010;116:584-92.
• Maharaj K, Sahakian E, Pinilla-Ibarz J. Emerging role of BCR signaling inhibitors in immunomodulation of chronic lymphocytic leukemia. Blood Advances. 2017;1(21):1867-1875.
• Malisan F, Fluckiger AC, Ho S, Guret C, Banchereau J, Martinez-Valdez H. B-chronic lymphocytic leukemias can undergo isotype switching in vivo and can be induced to differentiate and switch in vitro. Blood. 1996; 87:717-24.
• Mansouri L, Sutton LA, Ljungström V, et al. Functional loss of IκBε leads to NF-κB deregulation in aggressive chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med. 2015 Jun 1;212(6):833-43.
• Manusow D, Weinerman BH. Subsequent neoplasia in chronic lymphocytic leukemia. JAMA 1975. 232: 267–269
• MarascaR, Maffei R, Martinelli S, Fiorcari S, Bulgarelli J, Debbia G, et al. Clinical heterogeneity of de novo 11q deletion chronic lymphocytic leukaemia: prognostic relevance of extent of 11q deleted nuclei inside leukemic clone. Hematol Oncol. 2013 Jun;31(2):88-95. doi: 10.1002/hon.2028. Erratum in: Hematol Oncol. 2013 Spe;31(3):168.
• Martinelli S, Cuneo A, Formigaro L, Cavallari M, Lista E, Quaglia FM et al. Identifying High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia: A Pathogenesis-Oriented Appraisal of Prognostic and Predictive Factors in Patients Treated with Chemotherapy with or without Immunotherapy. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2016, 8:e2016047.
• Matutes E, Owusu-Ankomah K, Morilla R, et al. The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia. 1994; 8:1640-5.
• Mayr C, Speicher MR, Kofler DM, Buhmann R, Strehl J, Busch R, Hallek M, Wendtner CM.  Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2006 Jan 15;107(2):742-751.
• McLaughlin P, Estey E, Glassman A, et al. Myelodysplasia and acute myeloid leukemia following therapy for indolent lymphoma with fludarabine, mitoxantrone, and dexamethasone (FND) plus rituximab and interferon alpha. Blood. 2005; 105:4573–4575
• Messmer BT, Messmer D, Allen SL, Kolitz JE, Kudalkar P, Cesar D et al. In vivo measurements document the dynamic cellular kinetics of chronic lymphocytic leukemia B cells. J Clin Invest. 2005; 115:755-64.
• Molica S, Vacca A, Ribatti D, Cuneo A, Cavazzini F, Levato D et al. Prognostic value of enhanced bone marrow angiogenesis in early B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2002; 100:3344-3351.
• Molica S. Targeted therapy in the treatment of chronic lymphocytic leukemia: facts, shortcomings and hopes for the future. Expert Rev Hematol. 2017;10(5): 425-432.
• Montserrat E, Campo E. Small lymphocytic lymphoma/chronic lymphocytic leukemia. In: Canellos GP, Lister TA, Young BD editors. The Lymphomas 2nd edition. Saunders Elsevier, Philadelphia, 2006, pp. 406- 414.
• Morabito F, Mosca L, Cutrona G, et al. Clinical monoclonal B lymphocytosis versus Rai 0 chronic lymphocytic leukemia: a comparison of cellular, cytogenetic, molecular, and clinical features. Clin Cancer Res. 2013;19(21): 5890-5900
• Moreau EJ, Matutes E, A’Hern RP et al. Improvement of the chronic lymphocytic leukemia scoring system with the monoclonal antibody SN8 (CD79b). Am J Clin Pathol. 1997; 108:378-82.
• Moreno C, Greil R, Demirkan F, Tedeschi A, Anz B, Larratt L, Simkovic M, Samoilova O, Novak J, Ben-Yehuda D, Strugov V, Gill D, Gribben JG, Hsu E, Lih CJ, Zhou C, Clow F, James DF, Styles L, Flinn IW. Ibrutinib plus obinutuzumab versus chlorambucil plus obinutuzumab in first-line treatment of chronic lymphocytic leukaemia (iLLUMINATE): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2019 Jan;20(1):43-56.
• Morrison VA, Rai KR, Peterson BL, et al: Therapy-related myeloid leukemias are observed in patients with chronic lymphocytic leukemia after treatment with fludarabine and chlorambucil: Results of an intergroup study, cancer and leukemia roup B 9011. J Clin Oncol. 2002; 20:3878-3884.
• Muzio M, Apollonio B, Scielzo C, Frenquelli M, Vandoni I, Boussiotis V et al. Constitutive activation of distinct BCR-signaling pathways in a subset of CLL patients: a molecular signature of anergy. Blood. 2008; 112:188-95.
• National Comprehensive Cancer Network.  Chronic Lymphocytic Leukemia/Small Lymphocytic Lymphoma (Version 1.2017). https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/cll.pdf. Accessed January 21, 2017.
• Nieto WG, Almeida J, Romero A, et al. Primary Health Care Group of Salamanca for the Study of MBL. Increased frequency (12%) of circulating chronic lymphocytic leukemia-like B-cell clones in healthy subjects using a highly sensitive multicolor flow cytometry approach. Blood. 2009; 114(1):33-37
• Nowakowski GS, Maurer MJ, Habermann TM, et al. Percentage of smudge cells on routine blood smear predicts survival in chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol. 2010; 28:412-7.
• O’Brien S, Furman RR, Coutre S, Flinn IW, Burger JA, Blum K, Sharman J, Wierda W, Jones J, Zhao W, Heerema NA, Johnson AJ, Luan Y, James DF, Chu AD, Byrd JC. Single-agent ibrutinib in treatment-naïve and relapsed/refractory chronic lymphocytic leukemia: a 5-year experience. Blood. 2018 Apr 26;131(17):1910-1919.
• Oppezzo P, Vuillier F, Vasconcelos Y, Dumas G, Magnac C, Payelle-Brogard B et al. Chronic lymphocytic leukemia B cells expressing AID display dissociation between class switch recombination and somatic hypermutation. Blood. 2003; 101:4029-32.
• Oscier D, Wade R, Davis Z, Morilla A, Best G, Richards S et al. Prognostic factors identified three risk groups in the LRF CLL4 trial, independent of treatment allocation. Haematologica. 2010; 95:1705-1712.
• Pagel JM. A richter transformation PD-1 block party. Blood. 2017; 129(26):3397-3398.
• Palamarchuk A, Yan PS, Zanesi N, Wang L, Rodrigues B, Murphy M, Balatti V, Bottoni A, Nazaryan N, Alder H, Rassenti L, Kipps TJ, Freitas M, Croce CM, Pekarsky Y. Tcl1 protein functions as an inhibitor of de novo DNA methylation in B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL). Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:2555-6.
• Pedersen IM, Kitada S, Leoni LM, Zapata JM, Karras JG, Tsukada N et al. Protection of CLL B cells by a follicular dendritic cell line is dependent on induction of Mcl-1. Blood. 2002; 100:1795-801.
• Pekarsky Y, Croce CM. Role of miR-15/16 in CLL. Cell Death Differ. 2015 Jan;22(1):6-11.
• Pflug N, Bahlo J, Shanafelt T, Eichhorst BF, Bergmann MA, Elter T et al. Development of a comprehensive prognostic index for patients with chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2014; 124:49-62
• Pouvaret A, Guery R, Montillet M, et al. Concurrent cerebral aspergillosis and abdominal mucormycosis during Ibrutinib therapy for chronic lymphocytic leukemia. Clin Microbiol Infect. 2019 Jan 28. pii: S1198-743X(19)30038-2.
• Puente XS, Beà S, Valdés-Mas R, et al. Non-coding recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Nature. 2015 Oct 22;526(7574):519-24.
• Puente XS, López-Otín C. The evolutionary biography of chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 2013;45:229-31
• Puente XS, Pinyol M, Quesada V, Conde L, Ordóñez GR, Villamor N, et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Nature. 2011;475:101-5.
• Puiggros A, Collado R, Calasanz MJ, et al. Patients with chronic lymphocytic leukemia and complex karyotype show an adverse outcome even in absence of TP53/ATM FISH deletions. Oncotarget. 2017; 8:54297-54303.
• Quesada V, Conde L, Villamor N, Ordóñez GR, Jares P, Bassaganyas L, Ramsay AJ, Beà S, Pinyol M, Martínez-Trillos A, López-Guerra M, Colomer D, Navarro A, Baumann T, Aymerich M, Rozman M, Delgado J, Giné E, Hernández JM, González-Díaz M, Puente DA, Velasco G, Freije JM, Tubío JM, Royo R, Gelpí JL, Orozco M, Pisano DG, Zamora J, Vázquez M, Valencia A, Himmelbauer H, Bayés M, Heath S, Gut M, Gut I, Estivill X, López-Guillermo A, Puente XS, Campo E, López-Otín C. Exome sequencing identifies recurrent mutations of the splicing factor SF3B1 gene in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 2011;44:47-52.
• Randhawa JK, Ferrajoli A. A review of supportive care and recommended preventive approaches for patients with chronic lymphocytic leukemia. Expert Rev Hematol. 2016 Mar;9(3):235-44.
• Rawstron AC, Shanafelt T, Lanasa MC, et al. Different biology and clinical outcome according to the absolute numbers of clonal B-cells in monoclonal B-cell lymphocytosis (MBL). Cytometry B Clin Cytom. 2010;78 (suppl 1): S19-S23
• Riedell P, Carson KR. A drug safety evaluation of rituximab and risk of hepatitis B. Expert Opin Drug Saf. 2014;13:977-87.
• Rigolin GM, Cavallari M, Quaglia FM, Formigaro L, Lista E, Urso A, Guardalben E, Liberatore C, Faraci D, Saccenti E, Bassi C, Lupini L, Bardi MA, Volta E, Tammiso E, Melandri A, Negrini M, Cavazzini F, Cuneo A. In CLL, comorbidities and the complex karyotype are associated with an inferior outcome independently of CLL-IPI. Blood. 2017 Jun 29;129(26):3495-3498.
• Rigolin GM, Cibien F, Martinelli S, Formigaro L, Rizzotto L, Tammiso E, Saccenti E, Bardi A, Cavazzini F, Ciccone M, Nichele I, Pizzolo G, Zaja F, Fanin R, Galieni P, Dalsass A, Mestichelli F, Testa N, Negrini M, Cuneo A. Chromosome aberrations detected by conventional karyotyping using novel mitogens in chronic lymphocytic leukemia with “normal” FISH: correlations with clinicobiologic parameters. Blood. 2012;119:2310-3.
• Rigolin GM, del Giudice I, Formigaro L, Saccenti E, Martinelli S, Cavallari M et al. Chromosome aberrations detected by conventional karyotyping using novel mitogens in chronic lymphocytic leukemia: Clinical and biologic correlations. Genes Chromosomes Cancer. 2015; 54:818-26
• Rigolin GM, Formigaro L, Cavallari M, Quaglia FM, Lista E, Urso A, Guardalben E, Martinelli S, Saccenti E, Bassi C, Lupini L, Bardi MA, Volta E, Tammiso E, Melandri A, Negrini M, Cavazzini F, Cuneo A. An extensive molecular cytogenetic characterization in high-risk chronic lymphocytic leukemia identifies karyotype aberrations and TP53 disruption as predictors of outcome and chemorefractoriness. Oncotarget. 2017 Apr 25;8(17):28008-28020.
• Rigolin GM, Saccenti E, Bassi C, Lupini L, Quaglia FM, Cavallari M, Martinelli S, Formigaro L, Lista E, Bardi MA, Volta E, Tammiso E, Melandri A, Urso A, Cavazzini F, Negrini M, Cuneo A. Extensive next-generation sequencing analysis in chronic lymphocytic leukemia at diagnosis: clinical and biological correlations. J Hematol Oncol. 2016 Sep 15;9(1):88.
• Roberts AW, Davids MS, Pagel JM, Kahl BS, Puvvada SD, Gerecitano JF et al. Targeting BCL2 with Venetoclax in Relapsed Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med 2016; 374:311-322.
• Rose-ZerilliMJ, Forster J, Parker H, Parker A, Rodríguez AE, Chaplin T et al. ATM mutation rather than BIRC3 deletion and/or mutation predicts reduced survival in 11q-deleted chronic lymphocytic leukemia: data from the UK LRF CLL4 trial. Haematologica. 2014 Apr;99(4):736-42. doi: 10.3324/haematol.2013.098574.
• Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, Simon R, Davis RE, Yu X et al. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med.2001 Dec 3;194(11):1639-47
• Rossi D, Bruscaggin A, Spina V, Rasi S, Khiabanian H, Messina M, Fangazio M, Vaisitti T, Monti S, Chiaretti S, Guarini A, Del Giudice I, Cerri M, Cresta S, Deambrogi C, Gargiulo E, Gattei V, Forconi F, Bertoni F, Deaglio S, Rabadan R, Pasqualucci L, Foà R, Dalla-Favera R, Gaidano G. Mutations of the SF3B1 splicing factor in chronic lymphocytic leukemia: association with progression and fludarabine-refractoriness. Blood. 2011;118:6904-8.
• Rossi D, Cerri M, Capello D, et al. Biological and clinical risk factors of chronic lymphocytic leukaemia transformation to Richter syndrome. Br J Haematol. 2008;142:202-15.
• Rossi D, Fangazio M, Rasi S, Vaisitti T, Monti S, Cresta S, Chiaretti S, Del Giudice I, Fabbri G, Bruscaggin A, Spina V, Deambrogi C, Marinelli M, Famà R, Greco M, Daniele G, Forconi F, Gattei V, Bertoni F, Deaglio S, Pasqualucci L, Guarini A, Dalla-Favera R, Foà R, Gaidano G. Disruption of BIRC3 associates with fludarabine chemorefractoriness in TP53 wild-type chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2012;119:2854-62.
• Rossi D, Gaidano G. Richter syndrome: molecular insights and clinical perspectives. Hematol Oncol. 2009; 27:1-10.
• Rossi D, Khiabanian H, Spina V, Ciardullo C, Bruscaggin A, Famà R et al. Clinical impact of small TP53 mutated subclones in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2014, 123:2139-2147.
• Rossi D, Lobetti Bodoni C, Genuardi E, Monitillo L, Drandi D, Cerri M et al. Telomere length is an independent predictor of survival, treatment requirement and Richter’s syndrome transformation in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2009a; 23:1062-72.
• Rossi D, Spina V, Cerri M, Rasi S, Deambrogi C, De Paoli L et al; Stereotyped B-Cell Receptor Is an Independent Risk Factor of Chronic Lymphocytic Leukemia Transformation to Richter Syndrome; Clin Cancer Res 2009b;15:4415-4422.
• Royle JA , Baade PD, Joske D, et al. Second cancer incidence and cancer mortality among chronic lymphocytic leukaemia patients: a population-based study. Br J Cancer 2011. 105:1076-1081
• Salcedo I, Campos-Caro A, Sampalo A, et al. Persistent polyclonal B lymphocytosis: an expansion of cells showing IgVH gene mutations and phenotypic features of normal lymphocytes from the CD27+ marginal zone B-cell compartment. Br J Haematol. 2002 Mar;116(3):662-6.
• Santanam U, Zanesi N, Efanov A, Costinean S, Palamarchuk A, Hagan JP et al. Chronic lymphocytic leukemia modeled in mouse by targeted miR-29 expression. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107:12210-5.
• Scarfò L, Ferreri AJ, Ghia P; Chronic Lymphocytic Leukaemia; Crit Rev Oncol Hematol. 2016; 104:169-82.
• Seifert M, Sellmann L, Bloehdorn J, Wein F, Stilgenbauer S, Dürig J, Küppers R. Cellular origin and pathophysiology of chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med. 2012;209:2183-98.
• Seymour JF, Kipps TJ, Eichhorst B, Hillmen P, D’Rozario J, Assouline S, Owen C, Gerecitano J, Robak T, De la Serna J, Jaeger U, Cartron G, Montillo M, Humerickhouse R, Punnoose EA, Li Y, Boyer M, Humphrey K, Mobasher M, Kater AP. Venetoclax-Rituximab in Relapsed or Refractory Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 2018 Mar 22;378(12):1107-1120.
• Shahjahani M, Mohammadiasl J, Noroozi F, Seghatoleslami M, Shahrabi S, Saba F et al; Molecular basis of chronic lymphocytic leukemia diagnosis and prognosis; Cell Oncol 2015; 38:93-109.
• Shanafelt T, ASH 2018, LBA-4. http://www.bloodjournal.org/content/132/Suppl_1/LBA-4.
• Shanafelt TD, Wang XV, Kay NE, et al. Ibrutinib-Rituximab or Chemoimmunotherapy for Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 2019;381(5):432–443. doi:10.1056/NEJMoa1817073.
• Sharman JP, Coutre SE, Furman RR, Cheson BD, Pagel JM, Hillmen P, Barrientos JC, Zelenetz AD, Kipps TJ, Flinn IW, Ghia P, Eradat H, Ervin T, Lamanna N, Coiffier B, Pettitt AR, Ma S, Tausch E, Cramer P, Huang J, Mitra S, Hallek M, O’Brien SM, Stilgenbauer S. Final Results of a Randomized, Phase III Study of Rituximab With or Without Idelalisib Followed by Open-Label Idelalisib in Patients With Relapsed Chronic Lymphocytic Leukemia. J Clin Oncol. 2019 Jun 1;37(16):1391-1402. doi: 10.1200/JCO.18.01460.
• Solomon BM, Rabe KG, Moreira J, et al. Risk of Cancer in Patients with Clinical Monoclonal B-Cell Lymphocytosis (MBL): A Cohort Study of Newly Diagnosed Patients Compared to Controls. ASH Annual Meeting Abstracts. 2012; 120:2893
• Solomon BM, Rabe KG, Slager SL,  et al. Overall and Cancer-Specific Survival of Patients With Breast, Colon, Kidney, and Lung Cancers With and Without Chronic Lymphocytic Leukemia: A SEER Population-Based Study. J Clin Oncol 2013. 31:930-937
• Sorror ML, Storer BE, Sandmaier BM, Maris M, Shizuru J, Maziarz R et al. Five-year follow-up of patients with advanced chronic lymphocytic leukemia treated with allogeneic hematopoietic cell transplantation after nonmyeloablative conditioning. J Clin Oncol. 2008; 26:4912-20.
• Speedy HE,Kinnersley B, Chubb D, Broderick P, Law PJ, Litchfield K, Jayne S, Dyer MJ, Dearden C, Follows GA, Catovsky D, Houlston RS. Germline mutations in shelterin complex genes are associated with familial chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2016 Aug 15. pii: blood-2016-01-695692. [Epub ahead of print]
• Stamatopoulos K, Belessi C, Moreno C, Boudjograh M, Guida G, Smilevska T, et al. Over 20% of patients with chronic lymphocytic leukemia carry stereotyped receptors: Pathogenetic implications and clinical correlations. Blood. 2007; 109:259-70.
• Stevenson FK, Caligaris-Cappio F. Chronic lymphocytic leukemia: revelations from the B-cell receptor. Blood. 2004; 103:4389-95.
• Stilgenbauer S et al. Venetoclax in relapsed or refractory chronic lymphocytic leukaemia with 17p deletion: a multicentre, open-label, phase 2 study. Lancet Oncol. 2016; 17:768-778.
• Stilgenbauer S, Eichhorst B, Schetelig J, Hillmen P, Seymour JF, Coutre S, Jurczak W, Mulligan SP, Schuh A, Assouline S, Wendtner CM, Roberts AW, Davids MS, Bloehdorn J, Munir T, Böttcher S, Zhou L, Salem AH, Desai M, Chyla B, Arzt J, Kim SY, Verdugo M, Gordon G, Hallek M, Wierda WG. Venetoclax for Patients With Chronic Lymphocytic Leukemia With 17p Deletion: Results From the Full Population of a Phase II Pivotal Trial. J Clin Oncol. 2018 Jul 1;36(19):1973-1980.
• Stilgenbauer S, Sander S, Bullinger L, Benner A, Leupolt E, Winkler D et al. Clonal evolution in chronic lymphocytic leukemia: acquisition of high-risk genomic aberrations associated with unmutated VH, resistance to therapy, and short survival. Haematologica. 2007; 92:1242-5.
• Stilgenbauer S, Schnaiter A, Paschka P, Zenz T, Rossi M, Dohner K et al. Gene mutations and treatment outcome in chronic lymphocytic leukemia: data from the UK LRF CLL4 trial. Blood. 2014, 123:3247-3254.
• Strefford JC; The genomic landscape of chronic lymphocytic leukaemia: biological and clinical implications; Br J Haematol 2015; 169:14-31.
• Svensson T, Kättström M, Hammarlund Y, et al. Pneumococcal conjugate vaccine triggers a better immune response than pneumococcal polysaccharide vaccine in patients with chronic lymphocytic leukemia A randomized study by the Swedish CLL group. Vaccine. 2018;36:3701-7.
• Tadmor T, Shvidel L, Bairey O, et al. Richter’s trnasformation to diffuse large B-cell Lymphoma: A retrospective study reporting clinical data, outcome, and the benefit of adding rituximab to chemotherapy, from the Israeli CLL Study Group. Am. J. Hematol. 2014; 89(11): 218-222.
• Tam CS, Wolf M, Prince HM, et al.  Fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab for the treatment of patients with chronic lymphocytic leukemia or indolent non-Hodgkin lymphoma. Cancer 2006 Jun 1;106(11):2412-20
• ten Hacken E, Burger JA. Molecular pathways:targeting the microenvironment in chronic lymphocytic leukemia–focus on the B-cell receptor. Clin Cancer Res. 2014 Feb 1;20(3):548-56.
• Thompson PA, O’Brien SM, Wierda WG, Ferrajoli A, Stingo F, Smith SC, Burger JA, Estrov Z, Jain N, Kantarjian HM, Keating MJ. Complex karyotype is a stronger predictor than del(17p) for an inferior outcome in relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia patients treated with ibrutinib-based regimens. Cancer. 2015 Oct 15;121(20):3612-3621.
• Tobin G, Thunberg U, Karlsson K, Murray F, Laurell A, Willander K et al. Subsets with restricted immunoglobulin gene rearrangement features indicate a role for antigen selection in the development of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2004; 104:2879-85.
• Travis LB , Curtis RE, Hankey BF, Fraumeni JF Jr. Second cancers in patients with chronic lymphocytic leukemia. J Natl Cancer Inst 1992. 16;84(18):1422-7.
• Tsimberidou AM, O’Brien S, Kantarjian HM, et al. Hodgkin transformation of chronic lymphocytic leukemia: the M. D. Anderson Cancer Center experience. Cancer. 2006;107:1294-302.
• Tsimberidou AM, O’Brien S, Khouri I, et al. Clinical outcomes and prognostic factors in patients with Richter’s syndrome treated with chemotherapy or chemoimmunotherapy with or without stemcell transplantation. J Clin Oncol. 2006b;24:2343-51.
• Tsimberidou AM, Tam C, Abruzzo LV, O’Brien S, Wierda WG, Lerner S et al. Chemoimmunotherapy may overcome the adverse prognostic significance of 11q deletion in previously untreated patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer. 2009; 115:373-80.
• Tsimberidou AM, Wen S, McLaughlin P, et al. Other malignancies in chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma. J Clin Oncol. 2009; 27:904-1.
• Van Dyke DL, Shanafelt TD, Call TG, Zent CS, Smoley SA, Rabe KG et al. A comprehensive evaluation of the prognostic significance of 13q deletions in patients with B-chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol. 2010 Feb;148(4):544-50.
• Van DykeDL, Werner L, Rassenti LZ, Neuberg D, Ghia E, Heerema NA et al. The Dohner fluorescence in situ hybridization prognostic classification of chronic lymphocytic leukaemia (CLL): the CLL Research Consortium experience. Br J Haematol. 2016 Apr;173(1):105-13.
• Vardi A, Dagklis A, Scarfò L, et al. Immunogenetics shows that not all MBL are equal: the larger the clone, the more similar to CLL. Blood. 2013;121(22):4521-4528
• Varughese T, Taur Y, Cohen N, et al. Serious Infections in Patients Receiving Ibrutinib for Treatment of Lymphoid Cancer. Clin Infect Dis. 2018;67:687-92.
• Vitale C, Ferrajoli A. Richter Syndrome in chronic lymphocytic leukemia. Curr Hematol Malig Rep. 2016 Feb;11(1):43-51
• Wang L, Brooks AN, Fan J, Wan Y, Gambe R, Li S, Hergert S, Yin S, Freeman SS, Levin JZ, Fan L, Seiler M, Buonamici S, Smith PG, Chau KF, Cibulskis CL, Zhang W, Rassenti LZ, Ghia EM, Kipps TJ, Fernandes S, Bloch DB, Kotliar D, Landau DA, Shukla SA, Aster JC, Reed R, DeLuca DS, Brown JR, Neuberg D, Getz G, Livak KJ, Meyerson MM, Kharchenko PV, Wu CJ. Transcriptomic Characterization ofSF3B1 Mutation Reveals Its Pleiotropic Effects in Chronic Lymphocytic Leukemia. Cancer Cell. 2016 Nov 14;30(5):750-763.
• Wang L, Lawrence MS, Wan Y, Stojanov P, Sougnez C, Stevenson K, Werner L, Sivachenko A, DeLuca DS, Zhang L, Zhang W, Vartanov AR, Fernandes SM, Goldstein NR, Folco EG, Cibulskis K, Tesar B, Sievers QL, Shefler E, Gabriel S, Hacohen N, Reed R, Meyerson M, Golub TR, Lander ES, Neuberg D, Brown JR, Getz G, Wu CJ. SF3B1 and other novel cancer genes in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2011; 365:2497-506.
• Wenjie Xiong, Heng Li, Shuhua Yi, Zengjun Li Sr., Wei Liu, Rui Lv, Dehui Zou and Lugui Qiu. The Prognostic Significance of 13q Deletion with Different Size in Patients with B-CLPD. Blood. 2015 126:5050.
• Williams AM, Baran AM, Meacham PJ, et al. Analysis of the risk of infection in patients with chronic lymphocytic leukemia in the era of novel therapies. Leuk Lymphoma. 2018;59:625-32.
• Woyach JA, Furman RR, Liu TM, Ozer HG, Zapatka M et al. Resistance mechanisms for the Bruton’s tyrosine kinase inhibitor ibrutinib. N Engl J Med. 2014; 370:2286-2294.
• Woyach JA, Ruppert AS, Heerema NA, Zhao W, Booth AM, Ding W, Bartlett NL, Brander DM, Barr PM, Rogers KA, Parikh SA, Coutre S, Hurria A, Brown JR, Lozanski G, Blachly JS, Ozer HG, Major-Elechi B, Fruth B, Nattam S, Larson RA, Erba H, Litzow M, Owen C, Kuzma C, Abramson JS, Little RF, Smith SE, Stone RM, Mandrekar SJ, Byrd JC. Ibrutinib Regimens versus Chemoimmunotherapy in Older Patients with Untreated CLL. N Engl J Med. 2018 Dec 27;379(26):2517-2528.
• Xu Y, Wang H, Zhou S, et al: Risk of second malignant neoplasms after cyclophosphamide based chemotherapy with or without radiotherapy for non-Hodgkin lymphoma. Leuk Lymphoma.2013; 54: 1396-1404.
• Yamauchi T, Nowak BJ, Keating MJ, et al. DNA repair initiated in chronic lymphocytic leukemia lymphocytes by 4-hydroperoxycyclophosphamide is inhibited by fludarabine and clofarabine. Clin Cancer Res. 2001; 7:3580–3589
• Yuille MR, Condie A, Stone EM, Wilsher J, Bradshaw PS, Brooks L et al. TCL1 is activated by chromosomal rearrangement or by hypomethylation. Genes Chromosomes Cancer. 2001; 30:336-41.
• Zenz T, Brenner a, Dohner H, Stilgenbauer S. Chronic lymphocytic leukemia and treatment resistance in cancer: role of the p53 pathway. Cell Cycle. 2008, 7:3810-3814.
• Zenz T, Eichhorst B, Busch R, Denzel T, Häbe S, Winkler D et al. TP53 mutation and survival in chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol. 2010; 28:4473-4479.
• Zinzani PL, Rambaldi A, Gaidano G, Girmenia C, Marchetti M, Pane F, Tura S, Barosi G. Infection control in patients treated for chronic lymphocytic leukemia with ibrutinib or idelalisib: recommendations from Italian society of hematology. Leuk Res. 2019 Jun;81:88-94.
• Zhou Y, Tang G, Medeiros LJ, et al. Therapy-related myeloid neoplasms following fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab (FCR) treatment in patients with chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma. Mod Pathol. 2012; 25:237-45
• Zupo S, Cutrona G, Mangiola M, Ferrarini M. Role of surface IgM and IgD on survival of the cells from B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2002; 99:2277-8.