Il ruolo della citofluorimetria nella diagnostica dei linfomi non Hodgkin

La metodica di elezione per la diagnosi dei linfomi non Hodgkin è rappresentata dall’analisi immunoistologica di adeguati preparati bioptici prelevati da localizzazioni linfonodali o sedi extranodali. Tuttavia, non sono pochi i casi in cui l’esame citofluorimetrico di popolazioni cellulari del sangue periferico o midollare consente una diagnosi rapida e accurata, rendendo talvolta non indispensabile una conferma bioptica specie in pazienti anziani o con localizzazioni difficilmente accessibili. Va preliminarmente ricordato che l’indagine citofluorimetrica riveste un ruolo sempre più importante, ma non assoluto, nella definizione diagnostica dei linfomi non Hodgkin: a tale scopo concorrono anche la presentazione clinica, l’esame morfologico delle popolazioni cellulari neoplastiche e, in molti casi, l’analisi citogenetica e molecolare.

Linfomi non Hodgkin B indolenti
Nella diagnostica delle malattie linfoproliferative croniche di linea B, la dimostrazione della restrizione per una catena leggera delle immunoglobuline viene operativamente considerata prova di clonalità. Il primo approccio diagnostico nel sospetto di patologia linfoproliferativa B indolente è quindi teso a dimostrare da un lato l’appartenenza al lineage B, dall’altro la clonalità: una combinazione di marcatori semplice e informativa è data da CD45/CD19/sIg kappa/sIg lambda. Il secondo passo, dimostrata la presenza di un processo linfoproliferativo B maturo, consiste nel definire la presenza di un fenotipo caratteristico direttamente riconducibile a una specifica entità nosografica: gli antigeni più informativi in quest’ottica risultano essere CD5, CD10 e CD23 (Harris NL et al, 1994) (Tabella I). Oltre alla presenza o assenza di particolari antigeni va considerata anche l’intensità di espressione degli stessi: l’esempio più classico è quello dell’antigene B CD20, che risulta debolmente positivo nei casi tipici di B-CLL ed è invece positivo o intensamente positivo nella maggior parte delle altre patologie linfoproliferative croniche B.

Tabella I: Schema per la distinzione dei principali processi linfoproliferativi B leucemizzati

Il fenotipo CD19+/CD5-/CD23-/CD10- pone un problema di diagnosi differenziale tra varie patologie: il linfoma della zona marginale, la leucemia a cellule capellute (HCL) e il linfoma linfoplasmocitico (LPL). In questo caso è utile approfondire il fenotipo della popolazione B clonale utilizzando i marcatori CD103/CD25/CD11c, tutti espressi con particolare intensità nella HCL: le cellule HCL risultano inoltre tipicamente positive per il marcatore annessina-1. La diagnosi differenziale tra linfoma della zona marginale e il LPL è difficile da porre sulla base dei soli parametri citofluorimetrici: entrambi sono positivi per le Ig citoplasmatiche, anche se il LPL risulta positivo per alcuni marcatori plasmacellulari, come il CD138, e presenta nel contesto della popolazione neoplastica una componente plasmacellulare positiva per il fattore di trascrizione IRF4/MUM1 (Falini B et al, 2000).

Linfomi non Hodgkin B aggressivi
Il linfoma a cellule del mantello si caratterizza per la proliferazione di una popolazione di elementi cellulari di piccola taglia, che vanno necessariamente distinti, per le evidenti implicazioni prognostiche, dalle neoplasie linfoproliferative indolenti. Oltre al già citato fenotipo caratteristico (CD5+/CD19+/CD10-/CD23-/CD43+/CD103-), il linfoma mantellare presenta intensa positività per gli antigeni B-associati (CD20, CD22, CD79a), per la presenza di immunoglobuline di superficie (in genere IgM), e soprattutto per la ciclina D1, corrispondente alla traslocazione patogenetica t(11;14): la dimostrazione citofluorimetrica di tale ciclina è possibile (Elnenaei MO et al, 2001) ma tecnicamente difficile e di non routinaria applicazione.
Le cellule del linfoma B diffuso a grandi cellule si caratterizzano soprattutto per i parametri fisici aumentati (dimensioni e complessità); dal punto di vista citofluorimetrico è costante l’espressione dei marcatori B-associati e la presenza di immunoglobuline di membrana (in ordine decrescente IgM, IgG e IgA), mentre alcuni marcatori possono associarsi a varianti particolari (ad es. CD10 nei casi a fenotipo del centro germinativo, CD30 nei casi primitivi del mediastino, CD138 nella variante plasmoblastica). Alcuni linfomi B diffusi a grandi cellule possono esprimere CD5: tale variante non pare avere valore prognostico ma va considerata la diagnosi differenziale con la variante blastoide del linfoma a cellule del mantello (Kroft SH et al, 2000).
Il linfoma di Burkitt esprime generalmente gli antigeni B-associati, monta IgM di membrana e spesso è positivo per CD10. L’assenza di bcl-2 può rappresentare un elemento di distinzione rispetto agli altri linfomi aggressivi. Tuttavia, la distinzione tra linfoma di Burkitt e linfoma B diffuso a grandi cellule è uno di quei casi in cui risulta indispensabile la correlazione con i dati clinici, istologici (in particolare l’elevato indice di proliferazione) e citogenetico/molecolari (iperespressione di c-myc).

Linfomi non Hodgkin T/NK
A differenza delle patologie linfoproliferative B, in cui specifiche combinazioni di marcatori e la dimostrazione di clonalità individuano distinte entità nosologiche, nello studio delle neoplasie a cellule T mature la dimostrazione di clonalità è particolarmente difficile e comunque non univoca, in quanto anche l’eventuale individuazione di una restrizione per una regione variabile del TCR non è necessariamente prova di clonalità. Pertanto, uno degli scopi dell’analisi citofluorimetrica è la dimostrazione della presenza di un’anomalia fenotipica coerente col sospetto di una patologia maligna, come l’assenza di un antigene atteso, o l’anormale intensità di espressione di un antigene presente sulla controparte normale (Hastrup N et al, 1989). Il sospetto indotto dalla citofluorimetria potrà poi essere più agevolmente confermato dalla dimostrazione di clonalità tramite tecniche di biologia molecolare. Analogo discorso vale per le proliferazioni a cellule NK, in cui la dimostrazione di ipotetica clonalità si basa sull’omogeneità di espressione di alcuni antigeni associati a tali cellule (Zambello R et al, 1993; Hoffmann T et al, 2000).
Con i limiti accennati, le anomalie fenotipiche più frequenti nei processi linfoproliferativi T leucemizzati sono: assente espressione di marcatori T-associati (CD2, CD5, CD7), coespressione di CD4 e CD8, assente espressione di CD4 e CD8. Va ancora una volta sottolineato che tali anomalie possono essere riscontrate anche in condizioni reattive o in patologie infiammatorie e non rappresentano un indice definitivo di malignità.
La patologia linfoproliferativa leucemica di linea T/NK di più frequente riscontro è la leucemia a linfociti granulari (LGL), che può essere distinta in una forma T-LGL (85% dei casi) e una forma NK-LGL (15% dei casi). La diagnosi di LGL si basa sulla dimostrazione di una linfocitosi con >2000 linfociti granulati/mmc per almeno 6 mesi, o in alternativa dalla presenza di una dimostrazione molecolare di clonalità (Semenzato G, 1997). L’andamento clinico è particolarmente indolente anche se in alcuni casi si associano quadri di citopenia periferica di particolare severità, sintomi sistemici, infezioni ricorrenti e tendenza all’evolutività. Il fenotipo più frequente della T-LGL è dato da CD3+/CD4-/CD8+/TCRα/β ma sono possibili tutte le combinazioni di positività/negatività di CD4 e CD8, così come è segnalato (10% circa dei casi) il fenotipo CD3+/CD4-/CD8-/TCRγ/δ. Le cellule della T-LGL possono esprimere CD16 ma sono generalmente negative per CD56. I casi di NK-LGL sono negativi per i marcatori T ed esprimono nella maggior parte dei casi CD16, CD56, CD57 e HLA-DR.

BIBLIOGRAFIA

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• Falini B, Fizzotti M, Pucciarini A, et al. A monoclonal antibody (MUM1p) detects expression of the MUM1/IRF4 protein in a subset of germinal center B cells, plasma cells, and activated T cells. Blood 2000;95:2084-2092.
• Harris NL, Jaffe ES, Stein H, et al. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group. Blood 1994;84:1361-1392.
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• Semenzato G, Zambello R, Starkebaum G, et al. The lymphoproliferative disease of granular lymphocytes: updated criteria for diagnosis. Blood 1997;89:256-260.
• Zambello R, TrentinL, Ciccone E, et al. Phenotypic diversity of natural killer (NK) populations in patients with NK-type lymphoproliferative disease of granular lymphocytes. Blood 1993;81:2381-2385.