Citofluorimetria nelle SMD e nel MM

Mielodisplasia

Una volta esclusa la diagnosi di leucemia acuta o SLP, l’ analisi citofluorimetrica è inoltre in grado di valutare la presenza o meno di displasia in una o più linee cellulari. Nell’ ambito del LeukemiaNet (van de Loosdrecht et al, 2009) sono state identificate le principali alterazioni immunofenotipiche necessarie per la diagnosi di mielodisplasia: incremento percentuale dei blasti, anomala intensità di espressione dei marker di linea ed espressione aberrante di marker appartenenti a linee cellulari differenti da quella mieloide. In particolare, i blasti sono considerati patologici quando i valori percentuali sono maggiori o uguali al 3% della cellularità globale o quando l’ intensità di espressione dei marker di linea ( CD45, CD34, CD117, CD13, CD33, HLADR) dovesse risultare aumentata o ridotta rispetto alla stessa mostrata nei blasti normali (Fig .1).

Figura 1. Alterazioni displastiche per CD45 e SSC: riduzione della complessità cellulare nella serie granulocitica (verde) associata alla ridotta intensità di espressione del CD45 nei blasti (rosso). Wells DA et al, 2003 

La presenza di marker mieloidi come il CD11b o uno dei marker linfoidi  CD7, CD56, CD19, TdT ne descriverebbe le caratteristiche patologiche. Nell’ analisi dei granulociti neutrofili la perdita di granulazione (SSC low) è una delle caratteristiche più frequentemente osservate nelle MDS associato ad un alterato pattern di distribuzione cellulare nella combinazione di marker CD13, CD16, CD11b (Fig.2).

Figura 2. Alterazioni displastiche per CD13/CD16: normale maturazione della serie granulocitica (a) a confronto con due pattern displastici (b-c). Wells DA et al, 2003 

L’ assenza del CD10, normalmente espresso nei granulociti neutrofili maturi così come l’ espressione di maker linfoidi (CD2, CD7, CD56) raprresentano ulteriori  caratteristiche displastiche. Nell’ ambito dei monociti invece l’ alterato rapporto (aumentato o diminuito)  rispetto ai linfociti e l’ espressione di marker linfoidi (CD2,CD56, CD7, CD19) identificano il fenotipo displastico. Nella selezione dei monociti è importante utilizzare il CD36, o il CD64 o il CD33 associato al CD14 considerata l’elevata possibilità di overlapping tra la popolazione monocitaria e la popolazione granulocitaria displastica. Anche se meno convalidata la serie eritroide, intesa come popolazione CD45neg, CD71pos, CD235a pos, può essere considerata displastica per anomalie di espressione del CD45, CD71 e rapporto CD71/CD235a. A ciascuna delle alterazioni immunofenotipiche descritte è stato attribuito un punteggio la cui somma costituisce uno score prognostico citofluorimetrico (Wells DA et al, 2003; van de Loosdrecht et al, 2008). Ciascuna delle categorie delle MDS ha mostrato valore mediano significativamente più alto del valore ottenuto dai campioni di midollo osseo normale. Correlazioni significative sono state evidenziate tra lo score e la dipendenza da trasfusione, la progressione di malattia ed il WPSS.

Mieloma Multiplo

Nonostante le difficoltà inerenti al conteggio delle plasmacellule, lo studio citofluorimetrico delle stesse ha mostrato una incontrastata valenza nella valutazione diagnostica e soprattutto prognostica del paziente affetto da mieloma multiplo. Da un consensus di esperti (Rawstron AC et al, 2008) sono state pubblicate le caratteristiche fenotipiche da prendere in considerazione nella valutazione delle plasmacellule patologiche. Sono stati identificati i marcatori che meglio discriminano le plasmacellule normali da quelle patologiche, entrambe accomunate dall’ espressione del CD38 o CD138: la negatività del CD19 e la forte positività del CD56 assumono il maggior potere discriminante mentre risultano raccomandatati CD117, CD28, CD27 e CD20 (Fig.3).

Figura 3. Mieloma multiplo. Identificazione di due cloni immunofenotipicamente distinti (CD138+,CD56+,CD81+^dim,CD19- in rosso vs CD138+,CD81+^dim,CD56-,CD19- in verde) associati ad una popolazione immunofenotipicamente normale (CD138+,CD81+,CD19+,CD56-) 

Il conteggio delle plasmacellule patologiche andrebbe valutato come rapporto tra plasmacellule patologiche e plasmacellule normali: le plasmacellule patologiche >97% delle plasmacellule totali sono osservate comunemente nel mieloma multiplo mentre le plasmacellule normali >3% delle plasmacellule totali sono osservate nelle MGUS. Inoltre, ai fini prognostici è stato evidenziato come la presenza del CD19 o del CD28 e l’ assenza del CD117 identifichino i pazienti con più ridotta sopravvivenza libera da malattia e sopravvivenza globale (Mateo G et al, 2009).

Malattia Minima Residua nel mieloma multiplo

La citofluorimetria è una metodica che può essere facilmente ed ampiamente utilizzata nello studio della MMR nel mieloma multiplo.  A confronto con altre tecniche come il dosaggio delle catene leggere sieriche a citofluorimetria ha dimostrato una maggiore sensibilità (Paiva B et al, 2011) ed una maggiore rapidità nei tempi di risposta. E’ raccomandato acquisire almeno 100 plasmacellule neoplastiche per avere un conteggio accurato. Considerando 0.01% il limite di sensibilità dello studio citofluorimetrico, almeno 1000000 di eventi andrebbero acquisiti (Rawstron AC et al, 2008). Sebbene nel mieloma multiplo come nelle leucemia acuta siano stati identificati i fenotipi patologici, non bisogna dimenticare che i fenotipi associati al mieloma più frequentemente riscontrati, CD19-/CD56+ (60% dei casi) e  CD19-/CD56- (30% dei casi), rappresentano rispettivamente il 10% ed il 20% delle plasmacellule totali nei midolli normali (Peceliunas V et al, 2011). Quindi, l’ utilizzo di ulteriori marcatori e lo studio dell’ intensità di fluorescenza costituiscono un valido ausilio per discriminare le plasmacellule patologiche dalle normali nei midolli rivalutati dopo terapia (Fig 4).

Figura 4. Malattia minima residua nel mieloma multiplo.  La popolazione patologica CD138+,CD56+ (a) è ancora presente dopo induzione (b) e completamente sostituita da una popolazione fenotipicamente normale dopo autotrapianto (CD138+,CD19+,CD56-)(c,d) 

Bibliografia

• Mateo G, Montalban A, Vidriales MB et al. Prognostic Value of Immunophenotyping in Multiple Myeloma: A Study by the PETHEMA/GEM Cooperative Study Groups on Patients Uniformly Treated With High- Dose Therapy. J Clin Oncol 2011; 26:2737-2744
• Paiva B, Martinez-Lopez J, Vidriales MB et al. Comparison of Immunofixation, Serum Free Light Chain, and Immunophenotyping for Response Evaluation and Prognostication in Multiple Myeloma. J Clin Oncol 2011;29:1627-1633.
• Rawstron AC, Orfao A, Beksac M et al Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders. Haematologica 2008;93 (3) 431-438
• van de Loosdrecht AA, Alhan C, Bene MC et al. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: report from the first European LeukemiaNet working conference on flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Haematologica 2009;94:1124–34.
• van de Loosdrecht AA, Westers TM, Westra AH et al. Identification of distinct prognostic subgroups in lowand intermediate-1-risk myelodysplastic syndromes by flow cytometry. Blood 2008;111:1067–77.
• Wells DA, Benesch M, Loken MR et al. Myeloid and monocytic dyspoiesis as determined by flow cytometric scoring in myelodysplastic syndrome correlates with the IPSS and with outcome after hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2003;102:394–403