Citofluorimetria nella Malattia Residua Misurabile

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La Malattia Residua Misurabile (MRM) viene definita come l’evidenza di cellule leucemiche residue al di sotto dei limiti definiti dalla sensibilità delle metodiche utilizzate e pari rispettivamente ad 1 cellula ogni 104 o  106 leucociti. E’ importante monitorare la MRM per le seguenti ragioni: a) permette di definire obiettivamente un livello di remissione più profondo; b) aumenta il valore prognostico della risposta al trattamento; c) permette di prevenire la recidiva guidando un trattamento precoce; d) monitora efficacemente lo stato di malattia nel post-trapianto. Citometria a flusso e qPCR sono le metodiche principalmente utilizzate per monitorare la MRM sebbene sono sempre più diffuse nuove tecniche come digital PCR ed NGS. Ciascuna metodica differisce dall’altra per il numero di pazienti su cui può essere utilizzata e la sensibilità. Il focus di tale capitolo sarà l’utilizzo della citometria a flusso nello studio della MRM nella leucemia acuta mieloide (LAM) e linfoide (LAL), nel mieloma multiplo (MM) e nella leucemia linfatica cronica (LLC). Gli aspetti comuni dei successivi argomenti inerenti al monitoraggio della MRM saranno: capacità discriminante delle combinazioni di anticorpi monoclonali (AcMo) utilizzati per l’ identificazione dei fenotipi aberranti; limite di identificazione (LOD: (N/cellule totali) x 100%) e limite di quantificazione (LOQ: (N/cellule totali) x 100%); cellule costituenti il cluster leucemico (N) influenzato da un coefficiente di variazione (CV) che ne influenza la riproducibilità e dovrebbe mantenersi intorno al 10% (saranno richiesti pertanto 100 eventi patologici come cluster) (Wood BL, 2016; Arroz M et al, 2016).

 

MRM e LAM

 

Ci sono due approcci per effettuare il monitoraggio della MRM: 1) identificazione dei fenotipi associati alla leucemia (LAIP) oppure 2) identificazione dei profili di differenziazione/maturazione aberranti in quanto differenti dai profili normali (DfN). Generalmente il DfN viene utilizzato quando non ci sono informazioni relative al campione della diagnosi. Tuttavia è sempre bene utilizzare entrambi gli approcci per evitare errori su campioni in cui vi sia la scomparsa di alcuni LAIP  e quindi la comparsa di nuovi. A tal proposito, il gruppo ELN MRD Working Party sottolinea l’importanza dell’approccio combinato “LAIP-DfN” (Schuurhuis GJ et al, 2018). E’ stato inoltre stabilito che il numero minimo di anticorpi monoclonali da utilizzare per identificare la MRM debba essere 8, sebbene non siano stati fatti studi che provino tale suggerimento. Tuttavia, in passato è stato dimostrato come 6 AcMo piuttosto che 4 AcMo permettessero l’identificazione di più LAIP. Quindi avere 8 AcMo nella combinazione permetterebbe una migliore identificazione dei LAIP e discriminazione tra le cellule leucemiche e le cellule normomaturanti delle differenti serie emopoietiche. Per migliorare la possibilità di identificare i LAIP è altresì necessario utilizzare la stessa combinazione AcMo-Fluorocromo tra diagnosi e follow-up (ad esempio CD117-PE, CD13-PECy7, etc. per diagnosi e follow up).

Un altro punto molto dibattuto nella MRM delle LAM è il cut-off da utilizzare per quantificare le cellule LAIP-positive. E’ stato definito come cut-off di positività per una MRM un valore ≥ 0.1% perché tale soglia garantisce una frequenza dei LAIP al di sopra di quella relativa alle cellule rigeneranti. Strettamente legato a tale argomento è quindi la specificità dei LAIP utilizzati. Infatti solo la co-espressione tra marker immaturi (CD34 e CD117) e marker appartenenti alla linea linfoide (CD2, CD4, CD7, CD56, CD10, CD19) mostra la più alta specificità e la più alta capacità discriminante con le cellule normali e/o rigeneranti, mentre gran parte dei rimanenti LAIP (perdita di HLADR, CD13, CD33 etc, o iper-espressione) mostra una bassa specificità. Pertanto sono necessari meno LAIP ad alta specificità (almeno uno) o più LAIP a bassa specificità (almeno tre) per avere una MRM in grado di identificare i pazienti a più alto rischio di recidiva con una buona sensibilità (Rossi G et al, 2020) (Figura I). A tale argomento si associa inevitabilmente il numero di eventi da acquisire, il quale non dovrebbe essere inferiore ai 500.000 (500.000-1.000.000 di eventi) CD45 positivi ed almeno 100 LAIP positivi per identificare il cluster leucemico. L’insieme degli accorgimenti descritti assicurerebbe un adeguato rapporto tra LOQ e LOD (Heuser M et al, 2021).

 

Figura I. MRM post consolidamento nella LAM con evidenza di  3 LAIP (iperespressione di CD34, HLADR ed assenza del CD13).

 

Quanto al miglior time-point per effettuare la MRM, bisogna partire dal presupposto che tutti i lavori hanno sempre dimostrato un significativo valore predittivo della MRM a qualsiasi tempo di valutazione (post-induzione, post-consolidamento, pre- e post-trapianto). Le ultime linee guida ELN hanno però definito il post-induzione, post-consolidamento ed il pre-trapianto i tempi ottimali in cui valutare i pazienti con LAM in follow up (Döhner H et al, 2022).

 

MRM e LAL

 

E’ necessario anche nelle LAL stabilire la combinazione di AcMo che permette la migliore discriminazione tra cellule leucemiche e cellule normali/rigeneranti. Nella LAL B è stato stabilito come la combinazione tra CD19, CD34, CD10, CD20, CD38 e CD45 sia altamente efficiente a tale scopo. A migliorare la sensibilità dei predetti marker vi è l’identificazione di LAIP con l’espressione del CD123, CD81, CD21 e CD58. CD123, CD21 e CD58 sono espresse sulle cellule leucemiche, particolarmente CD19+/CD34+ ma non nella controparte normale (ematogoni) (van Dongen JJ et al, 2012; Kovach AE et al, 2023). Il CD81 è invece una tetraspasmina associata a percursori linfocitari B ma difficilmente espressa su cellule leucemiche. Poiché non esistono precursori T nel midollo osseo, più facilmente nella LAL T i LAIP sono determinati da tutti quei marker che identificano un fenotipo immaturo: TdT, CD99, CD1a, CD10, CD34. Nella LAL B in particolare sono state standardizzate due combinazioni che mostrano una concordanza con RQ-PCR pari al 93% ed una sensibilità di 10-5 purchè vengano acquisiti almeno 4.000.000 di eventi (il cluster leucemico deve contare 10 e 40 eventi rispettivamente per LOD e LOQ) (Theunissen P et al, 2017). Le combinazioni di 8 anticorpi hanno in comune CD45, CD19, CD10, CD20, CD38 e CD81, mentre differiscono per CD66c/CD123 o CD73/CD304. Questi ultimi marker sono risultati particolarmente utili nel discriminare le cellule leucemiche (CD123+, CD73+, CD304+, CD81-) dagli ematogoni di tipo I (CD81+, CD123-, CD73-, CD304-). Tuttavia è normalmente accettata una sensibilità di 10-4. I tempi di valutazione risultano essere: fine induzione , + 3mesi circa dall’inizio della terapia e poi ogni 3 mesi per circa 3 anni. I pazienti che saranno sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali dovranno effettuare la valutazione prima della procedura e successivamente ogni 3 mesi (Short NJ et al, 2019).

 

MRM nel MM

 

L’eterogeneità nell’identificazione della MRM nel MM tra i diversi laboratori di citometria ha condotto il Consiglio per la Standardizzazione in Ematologia Clinica (ICSH) e la Società Internazionale di Citometria Clinica (ICCS) a definire le principali linee guida per il monitoraggio della MRM (Rawstron AC et al, 2016). In particolare, si è sottolineata l’importanza dei 12 marker (CD45, CD38, CD138, CD56, CD19, CD27, CD117, CD28, CD81, B2M, Cyk,CyL) identificati dal Consorzio Euro Flow combinati in due tubi da 8 colori nel discriminare le plasmacellule normali o rigeneranti  dalle plasmacellule patologiche (Figura II). Le plasmacellule normali mostrano, infatti, un’espressione eterogenea del CD19, CD56 e CD45 mentre sono negative per CD20 e CD117 (Figura III). Il CD81 è particolarmente espresso nelle plasmacellule normali mentre CD117, CD56 e CD28 nella controparte patologica (Rawstron AC et al, 2016). Il tubo con le catene intracitoplasmatiche ha lo scopo di confermare la natura clonale del fenotipo aberrante precedentemente identificato (CD19, CD56+, etc.).

 

Figura II. MRM nel MM con evidenza di popolazione di plasmacellule patologiche  CD45+, CD38+, CD19+, kappa (cy)+.

 

Figura III. MRM nel MM con evidenza di una popolazione di plasmacellule patologiche (nera) CD45-, CD38+, CD56+, CD117+, lambda(cy)+ ed una popolazione di plasmacellule normali (rossa)  CD45+, CD38+, CD56+, CD117-, kappa(cy)+, lambda(cy)+.

 

Le combinazioni da 8 AcMo sono risultate fondamentali al fine di riconoscere i subset di plasmacellule normali coesprimenti marker aberranti tipicamente espressi sulle plasmacellule patologiche. Il cut-off ritenuto predittivo è 0,001%, che richiede l’acquisizione di almeno 3.000.000 di eventi per assicurare un adeguato LOD e 5.000.000 di eventi per assicurare un adeguato LOQ (considerando rispettivamente un cluster di 30 e 50 plasmacellule patologiche). Se dovessero essere acquisiti meno eventi non si raggiungerebbe un livello di sensibilità richiesto (10-5) (Wierda WG et al, 2021). Il time point ritenuto predittivo nella maggior parte degli studi è il post-trapianto, anche se recentemente ha assunto sempre maggior importanza la MRM sostenuta nei primi 12 mesi di mantenimento.

 

MRM nella LLC

 

Il gruppo ERIC ha validato una combinazione core di AcMo da utilizzare in un singolo tubo ad 8 colori che potesse determinare risultati riproducibili indipendentemente dal centro, dallo strumento o da eventuali AcMo aggiunti nei diversi laboratori. Il panel di esperti ha identificato un core di 6 AcMo (CD19, CD79b, CD20, CD43, CD5 e CD81) a cui eventualmente aggiungere CD45, CD200 o ROR1 per identificare meglio il clone leucemico o CD45 e CD3 per discriminare meglio dalle restanti popolazioni non LLC (Rawstron AC et al, 2016). E’ stato inoltre stabilito il numero minimo di eventi per avere un risultato riproducibile e di conseguenza  LOD e LOQ accettabili. Sono necessari almeno 20 eventi acquisendo 200.000 leucociti totali per avere un LOD di 0,01%; sono invece necessari 50 eventi e 500.000 leucociti acquisiti per avere un LOQ di 0,01%. Poiché più studi hanno mostrato un’alta concordanza della MRM tra sangue periferico e sangue midollare (> 85%), lo studio va effettuato su sangue periferico, tenendo in considerazione che il sangue midollare rappresenta la sorgente più sensibile, da utilizzare qualora vi sia una MRM non identificabile su sangue periferico (Wierda WG et al, 2021).

Il tempo di valutazione varia a seconda della tipologia di trattamento. Quindi, dovrà essere effettuato lo studio per MRM almeno due mesi dopo il completamento dell’ultimo ciclo di trattamento nel caso in cui vi siano dei trattamenti con una durata determinata. Nel caso in cui vi siano trattamenti continuativi lo studio per MRM andrà effettuato nei tempi in cui ci si aspetta la migliore risposta clinica. Poiché esistono casi di remissione parziale e MRM non identificabile, non bisogna considerare il monitoraggio per i soli casi in remissione completa.

 

BIBLIOGRAFIA

 

  • Arroz M, Came N, Lin P, et al. Consensus guidelines on plasma cell myeloma minimal residual disease analysis and reporting. Cytometry B Clin Cytom. 2016;90:31-9.
  • Döhner H, Wei AH, Appelbaum FR, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2022 recommendations from an international expert panel on behalf of the ELN. Blood. 2022;140:1345-1377.
  • Heuser M, Freeman SD, Ossenkoppele GJ, et al. 2021 Update on MRD in acute myeloid leukemia: a consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2021;138:2753-2767.
  • Kovach AE, Wood BL. Updates on lymphoblastic leukemia/lymphoma classification and minimal/measurable residual disease analysis. Semin Diagn Pathol. 2023;40:457-471.
  • Rawstron AC, Fazi C, Agathangelidis A, et al. A complementary role of multiparameter flow cytometry and high-throughput sequencing for minimal residual disease detection in chronic lymphocytic leukemia: an European Research Initiative on CLL study. 2016;30:929-936.
  • Rossi G, Giambra V, Minervini MM, et al. Leukemia-associated immunophenotypes subdivided in “categories of specificity” improve the sensitivity of minimal residual disease in predicting relapse in acute myeloid leukemia. Cytometry B Clin Cytom. 2020;98:216-225.
  • Schuurhuis GJ, Heuser M, Freeman S, et al. Minimal/measurable residual disease in AML: a consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party. Blood. 2018;131:1275-1291.
  • Short NJ, Jabbour E, Albitar M, et al. Recommendations for the assessment and management of measurable residual disease in adults with acute lymphoblastic leukemia: A consensus of North American experts. Am J Hematol. 2019;94:257-265.
  • Theunissen P, Mejstrikova E, Sedek L, et al. Standardized flow cytometry for highly sensitive MRD measurements in B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2017;129:347-357.
  • van Dongen JJ, Lhermitte L, Böttcher S, et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. 2012;26:1908-75.
  • Wierda WG, Rawstron A, Cymbalista F, et al. Measurable residual disease in chronic lymphocytic leukemia: expert review and consensus recommendations. 2021;35:3059-3072.
  • Wood BL. Principles of minimal residual disease detection for hematopoietic neoplasms by flow cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 2016;90:47-53.

A cura di:

Professore Associato in Ematologia, Università Cattolica del S. Cuore, Roma

Gina Zini
Gina Zini
Professore Associato in Ematologia, Università Cattolica del S. Cuore, Roma
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