Aggiornamenti di Diagnostica Molecolare in Ematologia (2024)

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Introduzione

 

Ai giorni nostri, una diagnostica avanzata delle neoplasie ematologiche non può prescindere dalla integrazione degli aspetti clinici, morfologici e immunofenotipici, con le alterazioni genetico-molecolari caratterizzate a livello di citogenetica, FISH e metodiche di biologia molecolare

Per alcune neoplasie la mutazione di un singolo gene è predominante e definente la malattia, tuttavia nella stragrande maggioranza di casi è presente un pattern complesso di alterazioni genetiche con la maggiore frequenza di talune rispetto ad altre e con la distinzione di mutazioni precoci driver, alterazioni tardive e mutazioni passeggere.

In ambito ematologico sono state identificate aberrazioni genomiche clinicamente rilevanti con impatto diagnostico, prognostico, predittivo di risposta ad un determinato trattamento e come marcatori di malattia residua misurabile (MRD), che necessitano di essere identificate e riportate per ogni singolo paziente.

I progressi tecnologici degli ultimi anni, soprattutto grazie alle metodiche di high-throughput sequencing, hanno cambiato la diagnostica molecolare muovendola da studi su singoli marcatori ad approcci più comprensivi con analisi di diversi geni contemporaneamente a livello di DNA e RNA. Ciò ha premesso di caratterizzare in maniera più approfondita il panorama genetico-molecolare delle neoplasie dei tessuti linfoide ed emopoietico ed ha contribuito alla revisione della loro classificazione nonché alla migliore definizione e distinzione di nuove e vecchie entità nosografiche.

Le metodiche di high-throughput sequencing hanno affiancato le tecniche tradizionali PCR-based e variano dalla target-sequencing di un limitato numero di geni alla whole exome sequencing (WES), che analizza le regioni codificanti dei geni, o alla whole-genome sequencing (WGS), che analizza l’intero genoma. Queste metodiche hanno diversa capacità di rilevare aberrazioni somatiche, in quanto gli approcci target hanno una più alta profondità di sequenza e maggiore sensibilità nel rilevare alterazioni subclonali rispetto a tecnologie genome-wide in grado invece di identificare mutazioni caratterizzate da una maggiore frequenza allelica. Le metodiche di target sequencing possono studiare DNA o RNA ed avere pannelli basati o su ampliconi o sulla tecnica dell’hybridization capture. Quest’ultimi pannelli sono in grado di studiare simultanemente multiple variazioni di singoli nucleotidi (SNVs), inserzioni/delezioni (indels), aberrazioni di numero di copie (CNAs) e varanti strutturali come riarrangiamenti. Sono stati sviluppati pannelli capture-based “tutto in uno” che possono identificare le alterazioni genomiche più frequenti nell’ambito delle neoplasie linfoidi e mieloidi, di più facile applicazione routinaria della diagnostica molecolare.

Le metodiche di Gene Expression Profiling (microarray) hanno contribuito ad indentificare, soprattutto nei linfomi, sottotipi biologicamente e prognosticamente distinti ed a studiare il microambiente tumorale. Sono stati sviluppati successivamente approcci target di più facile applicazione nella routine, come il Nanostring, la Reverse Transcriptase Multiplex Ligation–Dependent Probe Amplification (RT-MLPA) ed il Whole Transcriptome Sequencing.

 

Aggiornamenti di Diagnostica Molecolari nelle Neoplasie linfoidi

 

Analisi di Clonalità

 

L’analisi della clonalità è importante per distinguere proliferazioni reattive da neoplasie clonali del tessuto linfoide e si basa sullo studio del riarrangiamento e della diversità giunzionale del geni delle Immunoglobuline (IG) e del T-cell receptor (TCR). La metodica convenzionale BIOMED2 per lo studio della clonalità consiste in una multiplex PCR per diversi target genici (IgH, IgK, IgL, TCRG, TCRB) e successiva analisi delle dimensioni dei frammenti mediante melting curve, come descritto nel BIOMED2. Le proliferazioni clonali danno uno o due picchi, mentre quelle policlonali presentano una distribuzione gaussiana.

L’EuroClonality-NGS Working Group ha messo a punto un protocollo NGS-based per lo studio della clonalità che ha mostrato una maggiore sensibilità rispetto alla metodica convenzionale BIOMED2 soprattutto nella identificazione di piccoli clonotipi nell’ambito di un background policlonale con un limite di rilevamento intorno al 2,5%. L’alta sensibilità della metodica NGS-based è di aiuto soprattutto nello studio di linfomi con poche cellule neoplastiche nell’ambito di un background reattivo come il linfoma di Hodgkin e il linfoma a grandi cellule B ricco in linfociti T e istiociti, e consente una maggiore accuratezza diagnostica in neoplasie linfoproliferative di difficile diagnosi come i linfomi cutanei e le linfoproliferazioni in corso di immunodeficienza e disregolazione immune. L’analisi della clonalità con NGS rende inoltre l’interpretazione dei dati più obiettiva con una valutazione quantitativa e qualitativa dei clonotipi che consente la loro comparazione in pazienti con neoplasia linfoidi sincrone e metacrone che possono o meno derivare dallo stesso clone ancestrale.

Un’altra applicazione delle metodiche NGS-based è la determinazione dello stato mutazionale dei geni IgH riarrangiati, di rilevanza prognostica in alcune malattie, come la leucemia linfatica cronica.

Per l’interpretazione dei risultati dei test di clonalità, va sottolineato che clonale non sempre equivale a neoplastico, in quanto risultati clonali possono essere ottenuti anche in proliferazioni reattive e i linfomi possono generare un risultato policlonale a causa della qualità del campione, basso numero di cellule tumorali e incapacità di rilevare il clone B neoplastico per l’ipermutazione somatica dei geni IG.

 

Leucemia linfatica cronica/linfoma a piccoli linfociti (CLL/SLL)

Nella CLL/SLL le alterazioni genetiche rivestono una notevole importanza prognostica ed influenzano le scelte terapeutiche. Lo studio dell’ipermutazione somatica dei geni delle regioni variabili delle catene pesanti delle IG (IGHV) mediante NGS o sequenziamento convenzionale identifica pazienti IGHV non mutati (identità con le sequenze germline > 98%) con inferiore tempo all’inizio del trattamento, durata della risposta e sopravvivenza globale. Pazienti CLL con riarrangiamenti stereotipati del B-Cell Receptor o esprimenti IG lambda V3-21 con la mutazione puntiforme R110 hanno una prognosi distinta.

Le alterazioni di TP53, di solito bi-alleliche (mutazione e del17p) rappresentano il singolo parametro prognostico e predittivo più importante che deve essere testato prima di iniziare la terapia. Perfino mutazioni subclonali con una frequenza di variante allelica < 10% si associano a una prognosi inferiore. L’analisi mutazionale di BTK, PLCG2, CARD11 e BCL2 è raccomandata in caso di resistenza alla terapia target (ibrutinib e venetoclax).

 

Linfoma follicolare

 

Il linfoma follicolare è caratterizzato dalla presenza della traslocazione t(14;18)(q32;q21) nel 85-90% dei casi che viene comunemente analizzata con metodiche di nested-PCR, RQ-PCR e digital droplet PCR per la valutazione della risposta al trattamento ed il monitoraggio della malattia minima misurabile.

Le metodiche di NGS hanno rilevato mutazioni ricorrenti di geni coinvolti nella regolazione epigenetica, vie di segnalazione, interazione con il microambiente e fattori di trascrizione, che tuttavia non sono ancora entrate nella diagnostica routinaria di pazienti trattati con chemioimmunoterapia. Lo score prognostico m7-FLIPI che incorpora FLIPI, performance status ECOG e stato mutazionale di 7 geni (EZH2, ARID1A, MEF2B, EP300, FOXO1, CREBBP, e CARD11), non è risultato riproducibile nella pratica clinica, in quanto dipendente dal regime terapeutico scelto.

È raccomandata invece la ricerca di mutazioni di EZH2 in pazienti che devono essere trattati con l’inibitore di EZH2 tazemetostat.

Un’analisi mutazionale mediante target NGS può essere indicata per linfomi follicolari BCL2 negativi di difficile diagnosi.

 

Linfoma a cellule mantellari

 

Il linfoma mantellare è caratterizzato dalla iperespressione della ciclina D1, conseguenza della traslocazione t(11;14)(q13;q32) con riarrangiamento dei geni CCND1::IGH. L’immunoistochimica è in genere sufficiente per la diagnosi, mentre la FISH con sonde break-apart può servire per confermare i casi dubbi ed identificare i casi ciclina D1-negativi con riarrangiamento dei geni CCND2 or CCND3.

Le mutazioni di TP53 sono presenti in circa il 10% dei pazienti con nuova diagnosi di linfoma mantellare e si associano comunemente ad alto rischio MIPI, Ki67 >30%, cariotipo complesso e variante blastoide. La ricerca delle mutazioni di TP53, soprattutto se fatta in NGS, è clinicamente rilevante in quanto rappresenta il fattore prognostico negativo più robusto per refrattarietà alla chemioterapia, progressione precoce di malattia e morte prematura. Pazienti con sola delezione di TP53, non associate a mutazioni, hanno la stessa prognosi di pazienti con TP53 wild type.

 

Linfoma linfoplasmocitico

 

Il linfoma linfoplasmocitico (LPL) nella sua presentazione come macroglobulinemia di Waldenstrom è caratterizzato da mutazioni somatiche di MYD88 L265P nel 95-97% dei casi (identificate mediante ASO-PCR) e di CXCR4 nel 30-40% dei casi (studiate mediante sequenziamento e NGS). La presenza o assenza di queste due mutazioni ha un significativo impatto sulle caratteristiche cliniche e sulla risposta al trattamento e dovrebbe essere determinata in tutti i pazienti con LPL. Le mutazioni di MYD88 sono importanti nella diagnostica differenziale con altre neoplasie linfoidi sebbene siano state riportate in rari casi di linfomi della zona marginale e nel 2-3 % delle CLL.

 

Linfoma della zona marginale

 

Gli esami di diagnostica molecolare possono essere utili per la diagnosi differenziale dei linfomi della zona marginale con altri linfomi B indolenti associati ad alterazioni genetiche distintive. Gli esami di high-throughput sequencing  hanno identificato mutazioni ricorrenti di geni appartenenti alle vie di segnalazione del B-Cell Receptor, NF-kB e NOTCH, che non hanno tuttavia ancora applicazione nella diagnostica di routine.

Nei linfomi marginali tipo MALT le alterazioni cromosomiche variano in frequenza in base alla sede anatomica. Rilevante da un punto di vista terapeutico è la ricerca della traslocazione t(11;18)(q21;q21) con il gene di fusione BIRC3::MALT1, che si associa alla mancata risposta alla terapia antibiotica nei linfomi della zona marginale extranodale dello stomaco positivi all’Helicobacter Pylori.

 

Leucemia a cellule capellute

 

La mutazione BRAF V600E è presente nella quasi totalità dei casi di leucemia a cellule capellute, e la sua ricerca mediante ASO-PCR, supporta la diagnosi soprattutto nei casi a presentazione dubbia e la distingue da altre malattie linfoproliferative.

 

Linfoma diffuso a grandi cellule B e linfomi B aggressivi

 

L’analisi in Gene Expression Profiling (GEP) ha distinto i linfomi diffusi a grandi cellule B (DLBCL) in base alla cellula di origine (cell-of-origin, COO), in forme germinal center B-cell (GCB), activated B-cell (ABC) e un terzo gruppo non classificato, con significativo impatto prognostico. Gli algoritmi di immunoistochimica utilizzati routinariamente non riflettono fedelmente la classificazione COO secondo GEP. Al contrario, la metodica Nanostring Lymph2Cx, basata sull’espressione dell’RNA di 20 geni ed eseguibile anche su tessuti inclusi in paraffina, ha mostrato risultati sovrapponibili al GEP nella sottoclassificazione dei DLBCL, ma non è ancora ampiamente diffusa nella diagnostica routinaria.

Integrando approcci di diverse piattaforme analitiche, gli studi di NGS hanno rilevato una maggiore complessità biologica dei DLBCL e hanno portando all’identificazione di sottotipi genetici diversi per pathways oncogenici, impatto prognostico, e sensibilità alla terapia. L’algoritmo LymphGen, accessibile online (https://llmpp.nih.gov/lymphgen/index.php), identifica 7 sottotipi genetici di DLBCL, ognuno arricchito in aberrazioni genetiche (mutazioni, alterazioni del numero di copie e fusioni) in un set di geni predittivi. I sottotipi genetici del LymphGen sono: MCD (comprendente le mutazioni di MYD88 L265P e CD79B), BN2 (con traslocazioni di BCL6 e mutazioni di NOTCH2), N1 (con mutazioni di NOTCH1), A53 (con aneuploidia e delezione/mutazione di TP53), ST2 (con mutazioni di SGK1 e TET2), e EZB (con mutazioni di EZH2 e traslocazioni di BCL2), quest’ultimo distinto poi in EZB MYC+ e EZB MYC in base alla presenza di riarrangiamento, amplificazioni del numero di copie e mutazioni del gene MYC. Il LymphGen classifica circa il 63% dei DLBCL, con il 6% assegnati a più di un sottotipo, mentre il rimanente 37% non rientra in nessun sottotipo genetico. Sebbene non ancora di utilizzo nella diagnostica routinaria, lo sviluppo della medicina di precisione nei DLBCL richiederà l’incorporazione del profilo genetico nei trial clinici.

Nell’ambito della diagnostica dei linfomi B a grandi cellule, riveste notevole importanza l’identificazione mediante sonde FISH break-apart della contemporanea presenza delle traslocazioni di MYC e BCL2 (double-hit, DHIT). Tali linfomi vengono classificati come DLBCL/HGBCL con riarrangiamento MYC/BCL2 nella classificazione WHO-HAEM5, presentano generalmente un profilo GBC ed hanno risposte insoddisfacenti con la chemioimmunoterapia standard. Studi di espressione genica hanno permesso di identificare un profilo di espressione double-hit (DHITsig) basato su un pannello di 104 geni analizzati mediante piattaforma Nanostring (DLBCL90), in grado di indentificare un 20% di pazienti con linfomi DHIT con traslocazioni critpiche non identificabili con la FISH.

DLBCL/HGBCL con riarrangiamento MYC/BCL6 non vengono più considerati un’entità nosologica distinta e sono accomunati ai DLBCL/HGBCL NOS nella WHO-HAEM5.

Altre applicazioni della diagnostica molecolare nei linfomi B aggressivi includono:

– la ricerca delle traslocazioni di MYC con i geni IgH, IgK, IgL mediante sonde FISH dual color o break apart nel linfoma di Burkitt.

– la ricerca delle aberrazioni di 11q (in genere combinazione di aumento prossimale al 11q23.2-11q23.3 e perdita distale al 11q24-qter) mediante CGH-array o FISH per la diagnosi di Linfomi B a grandi cellule con aberrazioni di 11q;

– la ricerca del riarrangiamento di IRF4 mediante FISH per la diagnosi di linfomi B a gradi cellule con riarrangiamento di IRF4.

 

Linfoma di Hodgkin

 

La diagnostica molecolare nel linfoma di Hodgkin è stata ostacolata dalla rarità delle cellule neoplastiche nei campioni bioptici. L’analisi del DNA tumorale circolante rispecchia la genetica delle cellule di Hodgkin e Reed-Sternberg, e rappresenta una fonte facilmente accessibile per genotipizzare il DNA tumorale. Lo studio longitudinale del ctDNA mediante NGS durante la terapia rappresenta un biomarcatore di malattia minima residua che può integrare l’imaging PET per l’identificazione precoce di pazienti chemiorefrattari.

 

Mieloma multiplo

 

La FISH viene comunemente utilizzata per l’identificazione di gruppi di rischio citogenetico nei pazienti con mieloma. Ad oggi invece lo studio della malattia minima residua effettuata mediante la qPCR allele specifica per il riarrangiamento paziente-specifico dei geni delle Ig non è clinicamente rilevante al di fuori di trial clinici, ma alla luce dell’introduzione nell’algoritmo terapeutico di nuovi farmaci (anticorpi monoclonali, immunoconiugati e bispecifici), diventerà uno standard laboratoristico necessario per la valutazione della risposta al trattamento.

 

Linfomi a cellule T periferiche

 

Al contrario dei linfomi B, l’analisi della clonalità è spesso necessaria per confermare la natura neoplastica delle proliferazioni a cellule T, con l’avvertimento che il risultato di un riarrangiamento clonale del TCR non è sempre sinonimo di neoplasia a cellule T.

Gli studio di GEP e NGS hanno contribuito ad identificare aberrazioni generiche ricorrenti ed a caratterizzare i pathways molecolari coinvolti nella patogenesi dei linfomi a cellule T ed NK. In generale, in questi linfomi sono comuni alterazioni delle vie di segnalazione del TCR e JAK/STAT e mutazioni di geni regolatori epigenetici. Tali alterazioni, sebbene in molti casi non specifiche e ricorrenti in più sottotipi di linfoma, possono avere impatto prognostico e contribuire ad una diagnosi differenziale nei casi dubbi.

La presenza del riarrangiamento del gene ALK sul cromosoma 2p23 con diversi partner cromosomici (il più comune NPM1 sul cromosoma 5q35.1 in circa l’80% dei casi) identifica un sottotipo di linfoma a grandi cellule anaplastiche (ALCL) con espressione delle proteina di fusione ALK. Tale traslocazione cromosomica ha significato prognostico favorevole e rappresenta un possibile target terapeutico. Ai fini diagnostici è sufficiente dimostrare l’espressione della proteina ALK in immunoistochimica.

Il 20-30% dei ALCL ALK negativi presentano riarrangiamenti del gene DUSP22 associati a prognosi favorevole, mentre il 5-8% ha riarrangiamenti del gene TP63 (5–8%), che codifica una proteina di fusione p63, associata a comportamento clinico aggressivo e prognosi sfavorevole. Entrambi i riarrangiamenti sono identificabili tramite FISH.

Il profilo mutazionale dei linfomi a cellule T helper follicolari (TFHL) include mutazioni di geni coinvolti in pathways epigenetici come TET2, IDH2, DNMT3a, mutazioni della GTPasi RHOA, mutazioni del TCR signaling

PLCG1, CD28, FYN, and VAV1 e traslocazioni ricorrenti come ICOS::CD28, ITK::SYK, e fusioni di VAV1. Le mutazioni di TET2 e DNMT3a sono di frequente riscontro nell’emopoiesi clonale, che svolgerebbe un ruolo importante nella patogenesi dei TFHL e spiegherebbe l’associazione tra neoplasie mieloidi e TFHL, specie dopo terapia citotossica. In casi di difficile diagnosi la presenza delle mutazioni di RHOA e IDH2 supporta la diagnosi di TFHL.

Studi di GEP hanno distinto nell’ambito dei linfomi a cellule T periferiche (PTCL) NOS due sottogruppi molecolari, PTCL-TBX21 e PTCL-GATA3. I PTCL-TBX21 sono caratterizzati da bassa complessità genomica, alta frequenza di mutazioni di geni modificatori epigenetici (TET1, TET3 e DNMT3a) e outcome più favorevole; i PTCL-GATA3 sono associati ad alta complessità genomica, aumenti di STAT3 e MYC, mutazioni di TP53 e PRDM1 e prognosi sfavorevole. Un algoritmo immunoistochimico è stato proposto per riprodurre i due gruppi molecolari con 4 anticorpi (TBX21, CXCR3, GATA3 e CCR4), ma necessita di validazione.

Nelle leucemia a grandi linfociti granulati T (T-LGLL), sono comuni le mutazioni con guadagno di funzione di STAT3 e STAT5B. In particolare le mutazioni di STAT3 sono tipiche delle T-LGLL CD8+ e di T-γ/δ LGLL, mentre le mutazioni di STAT5B sono più comunemente associate a forme T-LGLL CD4+ indolenti e alla rara variante aggressiva di T-LGLL CD8+.

Mutazioni germline del gene HAVCR2 sono state descritte in pazienti con linfoma a cellule T simil panniculite, con due hotspot mutazionali: HAVCR2Y82C, prevalente in Asia Orientale, e HAVCR2I97M, prevalente in Europa. HAVCR2 codifica per TIM3, un recettore inibitore espresso sui linfociti T produttori di interferon γ, coinvolti nella regolazione dell’infiammazione. I pazienti con mutazioni di HAVCR2 sono giovani, hanno spesso la linfoistiocitosi emofagocitica associata ed una prognosi pessima. La ricerca delle mutazioni di HAVCR2 consente di stratificare il rischio e offre un possibile target per la terapia.

 

Approfondimenti diagnostici molecolari nelle leucemie acute linfoblastiche

 

La diagnostica tradizionale delle leucemie linfoblastiche acute (ALL) era basata su morfologia, immunofenotipo, citogenetica, FISH e un limitato numero di test molecolari per geni di fusione.

Gli studi genomici sulle ALL hanno permesso di identificare molteplici nuove entità nosografiche con distinte mutazioni driver e ben definiti profili di espressione genica rendendo gli approcci tradizionali insufficienti per una corretta classificazione della ALL.

La citogenetica convenzionale continua ad avere la sua utilità nell’individuare alterazioni quali aneuploidia (iperploidia o ipoploidia) e riarrangiamenti cromosomici. La FISH in interfase o in metafase rimane un approccio valido in quanto può identificare mediante sonde break-apart o di co-localizzazione molti riarrangiamenti cromosomici come pure l’amplificazione del cromosoma 21 nella B-ALL iAMP21.

I test molecolari basati su RT-PCR, usando primers sequenza-specifici per ciascun partner della traslocazione, consentono una rapida identificazione di geni di fusione ricorrenti nelle ALL, tra cui BCR::ABL1 (p190 e p210), ETV6::RUNX1, TCF3::PBX1 e UBTF::ATXN7L3. Sebbene rapida e utile nel monitoraggio della malattia minima misurabile, tale metodica risulta limitata a causa della grande diversità di partner di fusione.

L’identificazione comprensiva delle alterazioni molecolari delle ALL richiede però l’uso di tecniche di sequenziamento genico in particolare l’RNA-Seq.

Il sequenziamento target del trascrittoma (targeted Transcriptome Sequencing) usando Anchored Multiplex PCR (AMP) è in grado di identificare una vasta schiera di partner di fusione per geni selezionati, offrendo in aggiunta informazioni sulle mutazioni dei singoli geni e sul profilo di espressione genica. Diverse piattaforme commerciali sono disponibili.

Il sequenziamento dell’intero trascrittoma (whole Transcriptome Sequencing), usando primers random o oligo-dT può sequenziare tutto l’RNA o i soli trascritti poliadenilati e consentire di studiare riarrangiamenti, aneuploidia, mutazioni ed espressione genica. Può essere utile per lo studio di casi più complessi.

L’entità B-ALL BCR::ABL1-like è stata introdotta già dalla classificazione WHO-HAEM4 (2016) per giustificare quei casi con profili di espressione genica simili alle B-ALL BCR::ABL1 ma prive della traslocazione t(9;22) BCR::ABL1. L’identificazione di questa entità nosografica è importante per la stratificazione del rischio in quanto, rispetto alle forme non-BCR::ABL1-like, si associa a inferiori percentuali di remissioni complete, sopravvivenza libera da eventi e sopravvivenza libera la malattia, e maggiore persistenza di malattia minima misurabile con i protocolli ALL pediatrici e degli adulti. Per l’identificazione di casi di B-ALL BCR::ABL1-like sono stati messi appunto test di più facile applicazione nella diagnostica routinaria, come il “BCR/ABL1-like predictor”, basato sull’espressione di 10 geni in RT-PCR quantitativa, che ha una sensibilità del 88,5% ed una specificità del 100%.

Nell’ambito del monitoraggio della MRD, la qPCR allele specifica per il riarrangiamento paziente-specifico dei geni delle Ig o del TCR del clone neoplastico (possibile nel 95% dei pazienti) e la qRT-PCR per i trascritti dei geni di fusione (presenti nel 40% dei pazienti) sono le metodiche più comunemente utilizzate, con un elevato valore prognostico predittivo in grado di stratificare i pazienti per categorie di rischio, condizionare le scelte terapeutiche, inclusa l’indicazione al trapianto, e predire precocemente la recidiva di malattia. Queste metodiche sono state standardizzate nell’ambito del EuroMRD Consortium.

 

Approfondimenti diagnostici molecolari nelle leucemie acute mieloidi

 

A causa del loro preponderante impatto sul fenotipo e sulla prognosi della malattia, le alterazioni genetiche hanno la priorità nella classificazione delle leucemie acute mieloidi (AML), secondo l’International Consensus Classification e la WHO-HAEM5.

Le raccomandazioni dell’European Leukemia Net (2022) indicano i test genetico-molecolari da eseguire, in aggiunta alla citogenetica convenzionale, per definire sottotipo di AML e categoria di rischio e per identificare possibili approcci terapeutici target. Questi test possono essere eseguiti con kit diagnostici disponibili in commercio o su piattaforme NGS che testano simultaneamente mutazioni e riarrangiamenti di molteplici geni. In caso di sospetta AML con predisposizione germline, dovrebbe essere utilizzato anche un panello genico che includa gli alleli predisponenti noti.

Lo screening delle mutazioni genetiche per stabilire la diagnosi e indentificare target terapeutici dovrebbe includere: FLT3 (sia le mutazioni ITD sia le mutazioni puntiformi del dominio tirosinchinasico), IDH1, IDH2, NPM1, CEBPA, DDX41, TP53, ASXL1, BCOR, EZH2, RUNX1, SF3B1, SRSF2, STAG2, U2AF1, ZRSR2.

Lo screening dei riarrangiamenti genici include PML::RARA, CBFB::MYH11, RUNX1::RUNX1T1, riarrangiamenti di KMT2A, BCR::ABL1.

Viene inoltre raccomandato di testare le mutazioni dei seguenti geni aggiuntivi: ANKRD26, BCORL1, BRAF, CBL, CSF3R, DNMT3A, ETV6, GATA2, JAK2, KIT, KRAS, NRAS, NF1, PHF6, PPM1D, PTPN11, RAD21, SETBP1, TET2, WT1.

Per i pazienti con mutazioni di NPM1 o con core-binding factor (CBF)-AML, è raccomandato di eseguire alla diagnosi una valutazione molecolare quantitativa mediante polymerase chain reaction quantitativa (qPCR) o droplet digital PCR (dPCR) per facilitare il monitoraggio nella Malattia Residua Misurabile (measurable residual disease, MRD) dopo il trattamento.

Il monitoraggio molecolare della MRD viene eseguito con qPCR, sebbene siano in via di sviluppo metodiche di NGS e dPCR. Il limite di rilevamento è 10-3. Il midollo ha una sensibilità superiore rispetto al sangue periferico. Le alterazioni molecolari associate alla leucemia utilizzabili per il monitoraggio della MRD mediante qPCR sono le mutazioni di NPM1, i geni di fusione CBFB::MYH11, RUNX1::RUNX1T1, KMT2A::MLLT3, DEK::NUP214 e BCR::ABL1 e l’espressione di WT1.

Il monitoraggio della MRD mediante NGS non è ancora standardizzato e non dovrebbe includere mutazioni dei geni associati alla predisposizione germline e dei geni associati ad emopoiesi clonale (ASXL1, DNMT3A e TET2).

Il monitoraggio della MRD ha valore prognostico sia per il rischio di recidiva e per la sopravvivenza in pazienti trattati con regimi intensivi o meno intensivi che abbiano ottenuto la remissione completa. Tuttavia in alcuni pazienti, come quelli con CBF-AML o AML mutata per NPM1, i trascritti possono persistere a bassi livelli dopo il trattamento senza avere significato prognostico di recidiva.

 

Approfondimenti diagnostici molecolari nelle neoplasie mieloproliferative croniche

 

La leucemia mieloide cronica Philadelphia/BCR::ABL1 positiva è stata la prima neoplasia ematologica dove l’applicazione di test molecolari si è rivelata fondamentale nella gestione dei pazienti. Alla diagnosi, la Reverse Transcriptase PCR qualitativa su sangue periferico è mandatoria per identificare il tipo di trascritto BCR::ABL1 che possa essere appropriatamente monitorato per la risposta agli inibitori delle tirosinchinasi (TKI). Circa il 2-4% dei pazienti ha trascritti BCR::ABL1 atipici, che mancano dell’esone 2 di ABL1 (e13a3 o e14a3) o con atipici breakpoint di BCR (e1a2, e6a2, e8a2, or e19a2) che possono dare falsi negativi con i sets di primer/probe usati nei protocolli standard di RT-PCR.

La PCR quantitativa non è mandatoria alla diagnosi ma è utilizzata nella valutazione della risposta ai TKI. La risposta molecolare deve essere valutata in base all’International Scale (IS) come ratio del trascritto BCR::ABL1 sul trascritto ABL1 o su un altro trascritto di controllo accettato a livello internazionale (es. GUSB o BCR), e deve essere espressa e riportata come BCR::ABL1% su scala logaritmica, dove 1%, 0,1%, 0,01%, 0,0032%, e 0,001% corrispondono a diminuzione di 2, 3, 4, 4,5, and 5 logaritmi rispettivamente rispetto al baseline standardizzato. Un livello di trascritto BCR::ABL1 ≤0,1% è definito come risposta molecolare maggiore (MMR) o MR3. Un livello di trascritto di BCR::ABL1 ≤0,01% o malattia non rilevabile nel cDNA con >10.000 trascritti di ABL1 è definita come MR4. Un livello di trascritto di BCR::ABL1 ≤0,0032% o la malattia non rilevabile nel cDNA con >32.000 trascritti di ABL1 è definita come MR4,5. Un livello di trascritto di BCR::ABL1 ≤0,001% o la malattia non rilevabile nel cDNA con >100.000 trascritti di ABL1 è definita come MR5. Secondo le linee guida dell’European Leukemia Net la PCR quantitativa per BCR::ABL1 deve essere ripetuta ogni 3 mesi e sono state definite tappe miliari nella risposta al trattamento con TKI da conseguire per stabilire se un farmaco deve essere continuato o cambiato in caso di resistenza o risposta non ottimale.

In caso di resistenza al trattamento è indicato lo studio delle mutazioni di BCR::ABL1. La NGS è la metodica raccomandata per rilevare le mutazioni di BCR-ABL1 in pazienti non rispondenti in maniera adeguata a TKI, con sensibilità superiore rispetto al Sanger Sequencing (3% verso 20%, rispettivamente). Il tipo di mutazione di BCR::ABL1 può indirizzare la scelta del TKI.

Gli esami di genetica molecolare sono fondamentali nella diagnostica delle neoplasie mieloproliferative croniche (MPN) Philadelphia negative. Lo screening per la mutazioni driver su sangue periferico è raccomandato su ogni paziente con sospetta MPN Ph-negativa. La ricerca della mutazione JAK2 V617F è il primo test da eseguire per pazienti con sospetta policitemia vera (PV), trombocitemia essenziale (ET) o mielofibrosi idiopatica (MF); in caso di negatività di JAK2 V617F, dovrebbero essere testati CALR e MPL nei pazienti con sospetta ET o MF, mentre le mutazioni dell’esone 12 di JAK2 dovrebbero essere testati in pazienti sono sospetta PV JAK2 V617F negativi. Secondo la classificazione WHO la ricerca di marcatori complementari di clonalità, come mutazioni di ASXL1, EZH2, IDH1/IDH2, e SRSF2, è raccomandata in tutti i pazienti, ma in particolare nei pazienti negativi per le tre mutazioni driver e con caratteristiche midollari e cliniche consistenti con MF.

Nei pazienti con ET, la presenza della mutazione JAK2 V617F influenza il rischio trombotico ed è stata incorporata nel modello prognostico IPSET-thrombosis.

Le mutazioni di SRSF2, ASXL1, EZH2, IDH1/IDH2 e U2AF1-Q157 predicono una sopravvivenza globale ed una sopravvivenza libera da malattia inferiore nella MF, le mutazioni di RAS/CBL predicono resistenza al ruxolitinib, mente le mutazioni di CALR di tipo 1 si associano ad una sopravvivenza superiore. Il profilo mutazionale è stato inserito in nuovi modelli prognostici per la MF (MIPSS70, MIPSSv2 e GIPSS).

La presenza della mutazione di c-Kit D816V rappresenta un criterio diagnostico della mastocitosi sistemica ed è presente in oltre il 90% dei casi. La metodiche utilizzate per la ricerca di questa mutazione sono la PCR allele specifica qualitativa o quantitativa e la digital droplet PCR (ddPCR) con una sensibilità dello 0,01%–0,1%. Nei casi in cui la mutazione D816V è assente, altre mutazioni di c-Kit possono essere identificate mediante sequenziamento intero del gene. Nelle mastocitosi sistemiche aggressive possono essere presenti mutazioni geniche ricorrenti nelle neoplasie mieloidi identificabili mediante NGS.

La diagnostica delle ipereosinofilie, una volta escluse le cause secondarie, richiede la ricerca dei geni di fusione delle tirosinchinasi associate alle neoplasie mieloidi/linfoidi con ipereosinofilia, quali FIP1L1::PDGFRA, ETV6::PDGFRB, ZMYM2::FGFR1, PCM1::JAK2, ETV6::FLT3, ETV6::ABL1. La metodica di riferimento è la RT-PCR, mentre riarrangiamenti con partner cromosomici alternativi possono essere identificati mediante FISH o citogenetica convenzionale. La variante linfocitica dell’ipereosinofilia necessita della dimostrazione della clonalità del TCR mediante PCR o NGS. La ricerca delle mutazioni geniche ricorrenti associate a neoplasie mieloidi mediante NGS può essere utilizzata come marcatore di clonalità per differenziare la leucemia eosinofila cronica NOS dalla sindrome ipereosinofila idiopatica.

 

Approfondimenti diagnostici molecolari nelle sindromi mielodisplastiche

 

Il profilo mutazionale condotto mediante NGS è indispensabile per una corretta classificazione e stratificazione prognostica delle sindromi mielodisplastiche (MDS), nonché per la scelta del timing e del tipo di trattamento.

La classificazione WHO-HAEM5 del 2022 riconosce le classi di MDS con anomalie genetiche distintive: esse includono le MDS con pochi blasti e mutazioni di SF3B1, caratterizzate da buona prognosi e risposta al luspatercept, e le MDS con inattivazione biallelica di TP53, caratterizzate da ridotta sopravvivenza globale e libera da evoluzione leucemica e ridotta risposta a diversi tipi di trattamento. La International Consensus Classification 2022, oltre a riconoscere i sottotipi di MDS con mutazioni di SF3B1 e con mutazioni di TP53, introduce la categoria MDS/AML caratterizzate da conta blastica tra 10-19%, ulteriormente suddivise in MDS/AML con mutazioni di TP53, MDS/AML con anomalie citogenetiche correlate alla mielodisplasia e MDS/AML con mutazioni geniche correlate alle mielodisplasie definite da mutazioni dei geni ASXL1, BCOR, EZH2, RUNX1, SF3B1, SRSF2, STAG2, U2AF1, o ZRSR2.

Nel 2022, l’International Working Group for Prognosis in MDS (IWG-PM) ha proposto un modello prognostico clinico-molecolare chiamato Molecular-International Prognostic Scoring System (IPSS-M), che integra parametri clinici e citogenetici con il profilo mutazionale di 31 geni, consentendo una migliore stratificazione prognostica rispetto ai precedenti score IPSS e R-IPSS.

 

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A cura di:

Università Cattolica del Sacro Cuore, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, Roma

Università Cattolica del Sacro Cuore, Fondazione Policlinico Universitario A. Gemelli IRCCS, Roma

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